保幼激素和胰岛素激活Met-及ERK-信号通路调控飞蝗卵黄蛋白原表达的分子机制

发布时间：2020-04-22 06:39

【摘要】：飞蝗(Locusta migrataria,Lm)是一种重要的农业害虫,主要以禾本科植物为食,具有繁殖力强、型变、迁飞等特点,能给农业带来重大灾害。飞蝗属于不完全变态昆虫,其卵巢属于无滋式,飞蝗卵细胞成熟所需要的卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)由脂肪体合成后分泌到血淋巴,最后由卵母细胞通过胞吞摄入。在许多昆虫中,卵黄蛋白原的表达主要是受到体内保幼激素(juvenile hormone,JH)调控。目前主流观点认为,JH一方面能够通过其受体Methoprene-tolerant(Met)介导的直接转录调控途径调控昆虫卵黄蛋白原表达;另一方面,JH通过其受体Met触发其它转录因子表达,继而间接调控Vg表达。除此之外,越来越多的证据表明,在昆虫卵黄发生阶段,体内胰岛素样多肽(insulinlike peptide,ILP)信号通路能够参与到Vg表达调控过程中。然而,目前关于JH和ILP信号通路协同调控昆虫卵黄蛋白原的分子机制并不清晰。据此,本论文根据前期文献报道和实验探索,以飞蝗为研究对象围绕JH和ILP信号通路中关键转录因子调控卵黄蛋白原表达的分子机制开展研究。飞蝗中有两个Vg,被称为VgA和VgB,通过RACE克隆得到了飞蝗VgA和VgB的cDNA全长序列,并构建了其启动子区的双荧光素酶报告载体,在S2细胞中进行了激素诱导实验。成功制备了飞蝗Vg、Met和β-Actin抗体,检测了飞蝗脂肪体Vg的mRNA和蛋白表达模式。飞蝗Vg的mRNA和蛋白水平表达结果表明,Vg在卵黄发生前期开始生成,在卵黄发生中期的表达水平达到峰值,然后在卵黄发生后期下降。Met蛋白的表达模式与Vg蛋白的表达模式相近,表明他们之间存在着相互联系。RNA干扰Met后,Vg的表达受到了显著的抑制。早熟素(precocene)处理剥夺内源性保幼激素合成,再通过dsMet处理沉默Met,此时外源保幼激素类似物(methoprene)并不能诱导Vg的表达,表明Met参与JH诱导Vg表达的信号通路。另一方面,通过干扰关键信号转导因子ERK,抑制了飞蝗脂肪体中VgA和VgB的mRNA和蛋白表达,表明ERK在飞蝗卵黄发生过程中起着重要作用。早熟素和dsERK共同处理,同样显著抑制methopren对飞蝗Vg的诱导表达。在蛋白表达谱测定结果中,ERK的磷酸化水平在羽化后0-3 d上升到一个峰值,之后开始下降,这个过程是先于Vg的表达完成的。而此时飞蝗的JH滴度很低,主要是胰岛素在影响其发育,我们推测ERK磷酸化启动了飞蝗Vg的表达。根据这些结果推断,ERK可能在ILP和JH信号通路协同调控Vg表达过程中起重要作用。在飞蝗体内激素诱导实验中,ERK响应JH诱导,在30 min时达到了一个峰值。与ERK表达变化相类似,JH诱导VgA和VgB的表达也在30 min时显著上升并达到了一个峰值。ILP也诱导VgA和VgB的表达,但是两者之间的变化略有不同。VgA是在30min上升到峰值,随后下降到较低水平。VgB则是在上升到峰值后下降,但保持一定程度的表达。通过S2细胞中的诱导实验显示,VgA和VgB的启动子活性在JH和ILP的诱导下显著上升。以上实验结果表明,保幼激素和胰岛素都能诱导飞蝗中Vg表达,Met和ERK在其中可能发挥重要作用。我们推断,飞蝗卵黄发生与生殖过程由保幼激素和胰岛素信号通路协同调控。
【图文】：

-1 大肠杆菌中原核表达 Vg 蛋白部分片段和抗体特异性表达情况，2. IPTG 诱导后 Vg 蛋白表达情况，3. 超声超声波破碎后沉淀菌体中所含的蛋白表达情况，5. 使 检测 Vg 抗体结果。SDS-PAGE 凝胶电泳所用凝胶浓度-1 Expression of Vg in Escherichia coli and specificity of 抗体制备基因片段选取的蛋白表达的片段长度为 612bp载体构建选用的是 pET-30a，加上标签，最后诱的蛋白通过 Ni2+-His 亲和层析柱纯化，与弗氏佐耳白兔的皮下进行多点注射免疫反应，取血清

大肠杆菌中原核表达 Met 蛋白部分片段和抗体特异表达情况，2. IPTG 诱导后 Met 蛋白表达情况，3. 超声波破碎后沉淀菌体中所含的蛋白表达情况 5. 使测 Met 抗体结果。SDS-PAGE 凝胶电泳所用凝胶浓 Expression of Met in Escherichia coli and specificity o 的抗体制备 的基因片段选取的蛋白表达的片段长度为 29达的载体构建选用的是 pET30a，，加上标签，来的蛋白通过 Ni2+-His 亲和层析柱纯化，与大耳白兔的皮下进行多点注射免疫反应，取血果可以看到对飞蝗的 β-Actin 蛋白有很强识别
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S433.2

【参考文献】

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1 马世骏;;根除飞蝗灾害[J];科学通报;1956年02期

本文编号：2636264