禾谷镰刀菌硫氧还蛋白还原酶TRR基因功能研究

发布时间：2020-04-27 09:25

【摘要】：小麦赤霉病因严重威胁小麦的产量品质,阻碍小麦生产的稳步发展,受到世界的广泛关注。禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是引起小麦赤霉病的重要病原之一,其产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)严重威胁人畜的健康。许多酶或者非酶的机制可以有效清除活性氧,其中较为重要的机制是包含硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TRR)的硫氧还蛋白系统。硫氧还蛋白系统具有强烈的抗氧化和清除自由基的作用。目前已知,硫氧还蛋白还原酶在氧化型和还原型硫氧还蛋白的循环中起着关键作用,但其在植物病原真菌中的具体机制尚不清楚。在禾谷镰刀菌基因组中有一个硫氧还蛋白还原酶基因,命名为FgTRR。构建定位菌株发现FgTRR定位于细胞质中。通过与稻瘟病菌、酿酒酵母和烟曲霉的TRR基因进行序列比对发现,FgTRR具有FAD-binding domainⅠ(GXGXX,X为任意氨基酸)、FAD-binding domainⅡ(GXFAXGDV)和NADPH-binding domain(GGGXXA)等硫氧还蛋白还原酶家族典型的结构域;通过进化树比对发现FgTRR的亲缘关系同物种进化趋势基本一致。利用split-marker PCR的方法对TRR基因进行敲除,通过PCR水平和Southern blot水平的验证得到7个?TRR突变体。对?TRR突变体的生物学表型研究发现:与野生型菌株相比,?TRR突变体的菌丝生长速度明显减慢,对分生孢子的形态没有影响,但表现出产孢量下降和萌发延迟的现象,表明FgTRR在菌丝生长和分生孢子萌发中存在缺陷;与野生型菌株产生正常的子囊壳以及子囊不同,?TRR突变体产生的子囊壳形态较小且不能产生子囊和子囊孢子,进一步对有性生殖进行研究发现,?TRR突变体表现出雌性不育的现象,这些结果表明FgTRR虽不是有性生殖所必须,但严重影响有性生殖过程;?TRR突变体在0.7 M KCl、0.7 M NaCl、1 M山梨醇和0.2 g/L刚果红中表现出抗性减弱,在0.05%SDS中表现出抗性增强,表明FgTRR参与禾谷镰刀菌的盐胁迫、细胞壁和细胞膜的完整性;?TRR突变体在5 mM H_2O_2和15μM甲萘醌中表现出敏感性增强,抗性减弱的现象,表明FgTRR影响氧胁迫过程;?TRR突变体在色素积累方面存在缺陷,色素生物合成相关基因的表达水平显著降低;与野生型相比,?TRR突变体致病性下降94%,侵染小麦和玉米须的能力减弱,DON毒素的产量显著下降,DON毒素生物合成相关基因的表达量下降显著,表明FgTRR在致病性方面至关重要;用5 mM H_2O_2处理1 h后,野生型菌株和?TRR突变体的原生质体均表现出质膜的磷脂酰丝氨酸外翻,发生外翻的原生质体的比例分别为18%和33%,而在未经H_2O_2处理的?TRR突变体中V-FITC阳性原生质体的数量同样多于野生型菌株,对菌丝细胞内活性氧进行检测发现?TRR突变体中活性氧积累多于野生型菌株,上述结果表明FgTRR参与细胞凋亡过程。综上所述,本研究证明FgTRR在生长发育、有性生殖、色素合成、致病性和细胞凋亡等方面发挥重要的作用。
【图文】：

禾谷镰刀菌,序列比对,亚细胞定位,菌丝

图 1 禾谷镰刀菌 FgTRR 序列比对和进化树分析A）禾谷镰刀菌、酿酒酵母、稻瘟病菌和构巢曲霉 TRR 保守结构域的序列比对（B）禾谷镰刀菌 FgTRR 和其它菌 TRR 进化树分析Fig. 1 Alignment and phylogenetic tree of TRR in F. graminearum.(A) Sequence alignment of FgTRR with other fungal TRRs. Fg, F. graminearum; Mo, M. oryzae; An, A. nidulans; Sc, cerevisiae. Bold asterisks, arrows, triangles, and rhombuses denote a FAD-binding domain Ⅰ(GXGXX), a redox-activysteine pair (CAVC), a NADPH-binding domain (GGGXXA), and a FAD-binding domain Ⅱ(GXFAXGDV), respectiv(B) Phylogenetic tree of TRR in F. graminearum、Arabidopsis thaliana and parts of fungi..2 FgTRR-GFP 的亚细胞定位为明确 FgTRR 的亚细胞定位情况，我们构建了带有自身启动子的 FgTRR-GFP 重粒，随后转化得到亚细胞定位转化子 6 个，荧光显微镜对其萌发 12 h 的菌丝初步观现其荧光分布均匀。激光共聚焦显微镜对萌发 12 h 菌丝和分生孢子进行观察，发现果同在荧光显微镜中一致。结果表明 FgTRR 在分生孢子和萌发 12 h 的菌丝中均定细胞质中 (图 2)。

序列,亚细胞定位

图 2 FgTRR-GFP 的亚细胞定位Fig. 2 Subcellular localization of the FgTRR-GFP fusion protein in F. graminearum. GFP signal observation in hyphae anconidia was determined using a laser confocal microscope. Bar = 10 μm.3.3 FgTRR 敲除突变体的获得根据同源重组的原理，借助 PCR 扩增和 Split-marker PCR 的手段连接得到正确的除片段。通过制备野生型菌株原生质体、PEG 介导的原生质体转化 (Hou et al., 2002)抗性筛选，得到大约 350 个转化子。为鉴定出插入正确的转化子，提取部分转化子基组 DNA，利用相应引物进行验证。其中 7 个转化子通过 PCR 水平的验证，表现出正的检测结果，即无目的基因但同时具有上下游验证序列 (图 3)。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S432.44

【参考文献】