致病相关因子BcNop53和BcSnf2调控灰葡萄孢菌生长发育及致病性机理研究

发布时间：2020-05-11 16:26

【摘要】：灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)是典型的死体营养型植物病原真菌,寄主范围极其广泛,能够侵染1400多种植物,其引起的灰霉病对全球范围的农业生产造成严重危害,带来巨大的经济损失。近年来,随着全基因组序列的公开,灰葡萄孢菌致病的分子机理得到了广泛研究,使得人们对灰葡萄孢菌与寄主互作过程的认识不断更新。尽管已鉴定出多个致病相关基因,但该菌的致病调控机制尚未被充分发掘。构建突变体库是挖掘新基因及进行功能基因组学研究的有效途径,本研究利用农杆菌介导的遗传转化体系(ATMT),构建了一个约含9000个转化子的灰葡萄孢菌T-DNA插入转化子群体,采用番茄和草莓两种不同的寄主叶片进行致病性筛选,经三轮复筛从中获得400多个致病力丧失或下降的突变体。通过热不对称交错PCR(TAIL-PCR)进行侧翼序列的克隆及分析确定T-DNA的整合部位,从T-DNA标记的基因中选取了三个候选基因进行后续研究,并分别命名为BcNOP53、BcRAB-6A及BcSNF2。为研究候选基因的生物学功能及作用机理,我们对其进行了定向敲除及遗传互补,通过检测基因敲除突变体ΔBcnop53、ΔBcrab-6a及ΔBcsnf2的致病力,进一步确认了候选基因BcNOP53和BcSNF2与T-DNA插入突变体致病表型的相关性,并对其在调控病原物发育和致病过程中的生物学功能和机制展开了系统的研究。核糖体是细胞内负责蛋白质生物合成的重要细胞器,然而目前对于核糖体如何调节微生物的致病过程知之甚少。本研究结果表明,BcNop53具有与酵母Nop53p类似的功能,是核糖体60S亚基成熟后期的作用因子,对病原菌的生长、致病发育及致病力至关重要。BcNop53定位于细胞核内,该蛋白在酵母突变体ΔScnop53中表达能够完全恢复后者生长缓慢的缺陷;同样,BcNOP53基因缺失导致灰葡萄孢菌生长速率减慢。研究还发现,BcNOP53基因缺失导致灰葡萄孢菌致病力丧失且侵染结构形成受阻与病原物中活性氧(ROS)产生减少有关。此外,BcNop53缺失降低了灰葡萄孢菌分生孢子产量及对逆境胁迫的适应,改变了分生孢子及菌核形态,延缓分生孢子与菌核的萌发,并降低了细胞壁降解酶的活性;然而,ΔBcnop53菌核数量显著增加。将完整的BcNOP53基因导入ΔBcnop53能够完全恢复上述表型缺陷。Snf2家族是一类依赖ATP的解旋酶类似(helicase-like)蛋白,能够通过水解ATP获得能量来改变染色质的结构,从而改变组蛋白与DNA之间的接触,以便完成DNA复制、转录、重组或修复等生物学过程。通过生物信息学分析发现,BcSnf2是该家族中的一员,其在病原真菌中的生物学功能尚未见报道,本研究发现,BcSnf2在灰葡萄孢菌发育及致病过程中具有重要的作用,可调节某些特定基因的转录水平,推测Bc Snf2可能通过调控某些致病因子的转录水平参与灰葡萄孢菌的致病过程。BcSNF2基因缺失导致灰葡萄孢菌致病力显著减弱,同时导致灰葡萄孢菌生长速率下降、产孢量降低、孢子萌发迟缓、菌落与菌核的形态发生改变。利用转录组测序(RNA-seq)技术对ΔBcsnf2与野生型B05.10基因差异表达水平进行了分析,在差异表达基因中,除与生长发育相关的基因外,还富集到一些参与致病过程的基因,其中包括已经报导的灰葡萄孢菌致病因子,我们将在后续的研究中对BcSnf2及Snf2家族其他成员调控灰葡萄孢菌自身发育及其与寄主互作过程的机制进行系统的分析。简言之,本研究以灰葡萄孢菌为材料,构建T-DNA插入突变体库,从中鉴定出BcNOP53和BcSNF2两个新颖的致病相关基因并对其进行系统的生物学功能分析,阐释了灰葡萄孢菌生长、致病发育和侵入寄主等有赖于BcNop53调控相关蛋白合成及内源活性氧ROS产生的机制;同时解析了Snf2家族成员BcSnf2调控基因转录,影响病原菌生长发育及致病的生物学功能。本研究为核糖体发生及依赖ATP的染色质重塑复合物介导的表观遗传调控调节真菌致病过程的机制提供了新的见解,可能为解决真菌疾病开辟新的靶点,为作物灰霉病绿色防控提供理论依据。
【图文】：

灰葡萄孢菌,侵染循环,再侵染,农事

灰葡萄孢菌的侵染循环(Amselemetal.,2011)

插入位点,转化子,灰葡萄孢菌,基因组数据库

Fig.2.8 The feature map of the gene BC1G_02571 in Botrytis cinerea5）转化子 M7280该转化子致病力丧失，接种草莓及番茄叶片后，无可见病斑出现。TAIL-PCR 获得 259 bp T-DNA 片段，T-DNA 插入基因 BC1G_08709 与BC1G_08710 之间，该插入位点距离 BC1G_08709 起始密码子 90 bp，距离BC1G_08710 起始密码子 201 bp （图 2.9）。 BC1G_08709 基因由 1366 个核苷酸组成，包含 2 个外显子（图 2.10），，编码 437 个氨基酸的未知蛋白，包含一个 NOP53结构域；灰葡萄孢菌基因组数据库序列信息显示，BC1G_08710 基因序列全长为888 bp, 包含 3 个外显子，编码 207 个氨基酸的假定 GTP-binding 蛋白，包含结构域 Rab6 和 Ras，NCBI 最新数据显示 BC1G_08710 基因序列全长为 564 bp（图2.11），本研究中 BC1G_08710 基因序列参考灰葡萄孢菌基因组数据库中的序列信息。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S432.44

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