细菌S76拮抗禾谷镰刀菌机理及小麦储藏中菌群和毒素变异研究

发布时间：2020-06-08 16:54

【摘要】：禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病,是小麦生产上的重要病害,不仅导致小麦严重减产,还产生影响食品安全的真菌毒素。生物防控小麦赤霉病,能减少化学杀菌剂的施用,被认为是一种发展前景良好的防控途径。解淀粉芽孢杆菌S76及其产生的脂肽,能高效抑制禾谷镰刀菌,可开发成为控制小麦赤霉病的生物制剂。但是,芽孢杆菌及其脂肽与镰刀菌和小麦互作的分子机理尚无系统研究。同时,在田间感染了赤霉病的小麦,在储藏过程中麦粒的菌群及其毒素的变异规律如何,也不十分清楚。本研究利用分子生物学、遗传学、植物病理学的理论与技术,研究了S76菌株、S76产生的脂肽伊枯草菌素(Iturin,Itu)和丰原素(Fengycin,Fen)与禾谷镰刀菌和小麦的分子互作;利用宏基因组学、化学等技术,研究了受赤霉菌侵染的小麦,在储藏过程中菌群及其毒素的变异。主要结果如下:1.伊枯草菌素、丰原素和S76菌株与禾谷镰刀菌的多个基因互作,这些基因参与镰刀菌的不同代谢路径。通过基因芯片表达谱分析发现,伊枯草菌素和丰原素及其产生菌对麦角固醇合成、细胞膜磷脂合成、信号转导、细胞壁合成、聚糖合成与分解、糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol,GPI)锚定结构合成与GPI锚定蛋白等基因的表达有显著影响。进一步敲除了镰刀菌的这些基因,分析了基因缺失突变体对两种脂肽的反应,结合化学分析、磷酸化免疫检测,结果一致表明伊枯草菌素和丰原素在禾谷镰刀菌中具有多个靶点:包括膜脂、GPI锚定结构、细胞膜锚定蛋白(Ankyrin,ANK)以及细胞内蛋白。伊枯草菌素和丰原素通过控制镰刀菌甘油高渗透压调控(High-Osmolarity Glycerol,HOG)和细胞壁整合调控(Cell Wall Integrity,CWI)信号路径参与形成囊泡结构。进一步通过化学分析、磷酸化免疫检测,结果表明伊枯草菌素和丰原素通过诱导HOG信号路径调控渗透物质甘油的合成,以提高细胞内渗透压,同时诱导CWI信号路径调控几丁质的合成,降低细胞壁的保护作用,是其引起镰刀菌产生囊泡结构重要原因。2.伊枯草菌素和丰原素能诱导小麦的赤霉病抗性、促进小麦生长、延缓小麦萌发以及抑制赤霉菌毒素合成的作用。RNAseq表达谱分析表明,伊枯草菌素和丰原素可激活小麦活性氧、超敏反应、控制气孔关闭、泛素化降解、水杨酸和乙烯等抗病基因以及激素合成调控基因表达,促进小麦胼胝体沉积和双氧水积累,提高小麦的赤霉病抗性。通过分析赤霉菌在侵染小麦过程中毒素合成路径基因表达及化学测定小麦籽粒的毒素含量结果表明,伊枯草菌素和丰原素能显著抑制镰刀菌毒素合成基因表达,降低麦粒中的毒素含量。3.S76菌株诱导侵染小麦的禾谷镰刀菌的水解酶类基因表达。RNAseq表达谱分析表明,S76菌株能诱导禾谷镰刀菌纤维素酶、半纤维素酶及糖苷酶等多糖水解酶基因表达。敲除禾谷镰刀菌水解酶基因,对敲除突变子后培养基中碳源利用和致病力分析研究表明,禾谷镰刀菌纤维素酶(Fg01596)和糖基水解酶(Fg06873)基因通过降解小麦细胞壁的纤维素为菌丝生长提供碳源,进而增强禾谷镰刀菌对小麦的致病能力。4.小麦储藏不同时间(0、3、6、9和12个月)、不同位置(上层、中层和下层)的菌群类型和毒素含量变化很大。在储藏开始(0月)时,真菌菌群中存在105个能被分类鉴定的物种(81个属),其中4个的相对含量超过10%,包括链格孢(12%)、花状绒黑粉类酵母(27%)、禾谷镰刀菌(12%)和好干性酵母(12%);还有41个尚不能被分类鉴定的物种。在粮仓的上层中,真菌的多态性和镰刀菌的相对丰度显著低于中层和下层。在储藏3个月后雪腐镰刀烯醇(Nivalenol,NIV)和脱氧雪腐镰刀烯醇(Deoxynivalenol,DON)毒素含量比0月时高13%-34%,储藏6至12个月时,中层和下层麦粒毒素的含量比0月时高24%-57%。但黄曲霉菌和黄曲霉毒素在储藏开始时及储藏过程中的含量都很低。这些研究结果为揭示S76菌株控制禾谷镰刀菌的分子机理、发展基于S76菌株的小麦赤霉病防控技术提供了信息和依据,还为降低小麦储藏过程中镰刀菌毒素污染提供了信息和方法。
【图文】：

图 2-1 同源敲除策略图EO：新霉素抗性基因；NEOpf 和 NEOpr：扩增抗性标记基因引物；upf 和 upr：扩同源区引物，upr 与 NEO 抗性基因 5’端有 15 bp 的重叠区；dpf 和 dpr：扩增下游同物，，dpf 与 NEO 抗性基因 3’端有 15 bp 的重叠区；ujdpf 和 ujdpr：上游同源区特异点鉴定引物；djdpf 和 djdpr：下游同源区特异插入位点鉴定引物。Fig. 2-1 The schema for homologous knockoutEO: Neomycin resistence gene; NEOpf and NEOpr: the primers of amplication neomsistence gene; upf and upr: the primers of amplication up stream homologus region, upr bp overlap region with neomycin resistence gene 5’; dpf and dpr: the primers of amplica stream homologus region, dpf have 15 bp overlap region with neomycin resistence gendpf and ujdpr: indentification primers of specific insert site on up stream homologus regdpf and djdpr: indentification primers of specific insert site on down stream homologus reg2.7.2.2 Cassette1）分生孢子制备

3.2ITS2 和 V3V4 区域 PCR 扩增，利用真菌的通用引物 ITS3（5’-GAACGCAGC-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-NA 的 ITS2 区域，利用细菌通用引物 341F（5’-ACTCCTACGG-3’）和 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）扩增细区域。扩增出的 ITS2 和 V3V4 扩增子按照 Illumina 测序分析的ra DNA library Prep Kit（New England Biolabs, Inc., USA）建成文库，文库在华大基因公司（BGI, Wuhan, China）利用 PE250 平台测序分析。华中农业大学 2018 届博士研究生学位论文
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.12;S476.1


本文编号：2703371