6-磷酸海藻糖磷酸酯酶在球孢白僵菌抗逆和侵染过程中的功能和机制

发布时间：2020-06-25 00:01

【摘要】：昆虫病原真菌球孢白僵菌作为一种重要的生物防治菌剂,在世界范围内广泛应用。然而,微生物菌剂的田间稳定性和杀虫速度仍然不能令人满意,并且已成为影响真菌杀虫剂应用的重要因素。海藻糖不仅可以作为体内重要的碳源,还在许多生物的环境应激反应中起着重要作用。海藻糖合成代谢通路中,第二步是由6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(Tpp)催化6-磷酸海藻糖合成海藻糖,球孢白僵菌的海藻糖合成代谢通路是调控真菌生长发育、抗逆和致病力的重要枢纽,但目前关于生防真菌中海藻糖代谢的生物学功能的研究报道有限,本文以6-磷酸海藻糖磷酸酯酶基因作为切入点,利用同源重组的方法敲除BbTpp基因,通过Tpp基因的缺失对菌株的抗逆力和毒力产生的影响,解析其功能机制,为菌株改良提供了新的思路。主要研究内容及结果如下:(一)首先通过对分生孢子的大小、产孢量和萌发率比较分析,在SDAY平板上培养期间,ΔBbTpp产孢困难,第7d的分生孢子产量比野生型菌株明显下降98.1%;在萌发率的测定中,分生孢子GT_(50)在ΔBbTpp菌株中较野生型菌株延长6.5%;在菌落面积的实验中,ΔBbTpp菌落面积在14种CZP衍生的不同碳氮源培养基平板上的菌落面积缩小68~83%。通过流式细胞仪测定孢子大小实验中发现,ΔBbTpp敲除菌株的的大小和复杂度较野生菌株上升11%和50%,表明BbTpp调节球孢白僵菌产孢量和孢子特性。(二)通过高效液相色谱法测定球孢白僵菌的胞内海藻糖的含量,与野生菌株相比,ΔBbTpp的海藻糖含量显著下降了96%,在敲除菌株中几乎没有海藻糖的生成,验证了Tpp参与海藻糖合成途径,表明BbTpp是球孢白僵菌中海藻糖合成所必须的。BbTpp主要通过调节海藻糖合成途径调控海藻糖的积累,从而影响球孢白僵菌分生孢子的抗逆和毒力。(三)然后,在化学胁迫的实验中,ΔBbTpp对不同化学胁迫的敏感性都高于野生菌株,ΔBbTpp敲除菌株对氧化剂H_2O_2和甲萘醌的EC_(50)分别较野生菌株下降了20%和27%;ΔBbTpp分生孢子对刚果红的胞壁干扰胁迫抵抗力下降18%;在高温胁迫和UV-B辐射实验中,ΔBbTpp分生孢子对紫外辐射胁迫的耐受力比野生菌株降低20%,对45°C高温胁迫的半致死时间LT_(50)比野生型降低15%,ΔBbTpp敲除菌株在耐氧化、耐热和耐紫外等外部逆境压力方面都有所下降。(四)最后,在毒力生物测定中通过体壁感染,BbTpp的缺失导致LT_(50)从3.9d延长到8.3天;通过血腔注射,BbTpp的缺失引起致死50%大蜡螟幼虫的LT_(50)从4.8 d延长到5.8 d,而该基因的异位回补则使得该缺陷得以恢复。ΔBbTpp敲除菌株的毒力显著降低,说明BbTpp在较大程度上影响球孢白僵菌的生防潜能。总之,Tpp在维持海藻糖合成、分生孢子质量、多重耐受性和毒力方面发挥调节作用,这突出了它们对真菌对环境和宿主的适应性的重要性。
【学位授予单位】：齐鲁工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S476.12
【图文】：

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本文编号：2728554