西花蓟马抗药性监测及SgAbd-1-like基因的克隆和定量分析

发布时间：2020-07-10 22:39

【摘要】：西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande)是一种重要的入侵害虫,自2003年入侵我国以来,已在北京、云南、山东、新疆、浙江、贵州、江苏、吉林、宁夏、西藏等多个地区广泛分布,成为我国园艺作物上最具威胁的害虫之一。由于杀虫剂的大量使用,加之西花蓟马具有世代周期短、繁殖力强及孤雌生殖等特点,导致西花蓟马的抗药性发展迅速,急需制订有效的抗性治理策略。抗药性监测和抗药性机理研究是抗性治理的基础和依据,本研究对西花蓟马田间种群进行了抗药性监测;调查了拉萨地区西花蓟马的发生规律并建立了种群生命表;以多杀菌素敏感(Ivf03)和抗性(NIL-R)近等基因系西花蓟马种群为研究材料,对转录组数据库中的差异表达基因——内表皮糖蛋白基因(endocuticle structural glycoprotein,缩写为SgAbd-1-like)进行了克隆和定量分析;建立了西花蓟马的RNA干扰体系,为后续基因功能研究奠定基础。主要研究结果:1.西花蓟马田间种群对不同药剂的抗性监测从云南嵩明、元谋和上蒜、北京昌平、顺义和海淀、辽宁台安地区采集田间西花蓟马种群,测定了其对乙基多杀菌素、多杀菌素、高效氯氰菊酯、溴虫腈、阿维菌素、噻虫嗪和甲维盐的抗药性水平。结果表明,上述7个地区的西花蓟马均对多杀菌素类药剂产生了抗药性,其中北京昌平、顺义和辽宁台安地区的抗性水平高达近十万倍,建议停止使用。各地区种群对阿维菌素、噻虫嗪、高效氯氰菊酯较为敏感,推荐使用。辽宁台安和北京海淀地区种群分别对溴虫腈和甲维盐产生中等水平抗性,建议在这两个地区减少使用这两种药剂。2.西藏拉萨西花蓟马田间种群生命表及发生规律调查通过建立西藏拉萨地区西花蓟马种群的两性生命表,并采用黄板诱集成虫的方法调查了日光温室番茄上西花蓟马的周年发生动态。结果发现,该种群西花蓟马成虫前期总发育历期为12.54 d,2龄若虫发育历期为5.62 d,占成虫前期发育历期的44.8%,卵能存活到成虫阶段的概率为0.598。雌虫的平均寿命为15.18 d,雄虫为9.64 d。该种群的内禀增长率(r)和净增殖率(R_0)分别为0.153/d和22.817。在拉萨日光温室番茄上能够周年发生,种群增长呈“单峰”型,6月中旬至8月上旬为发生盛期。3.SgAbd-1-like基因克隆及定量分析西花蓟马SgAbd-1-like基因全长为1016 bp,开放阅读框为723 bp,5’UTR和3’UTR分别为89 bp,207 bp,编码240个氨基酸,无信号肽。预测的等电点(pI)为5.95,为偏酸性蛋白,分子量(Mw)为26.681 KDa,且无跨膜结构。与大部分其他物种的SgAbd-1-like基因一样,西花蓟马的SgAbd-1-like基因含有1个保守区域:几丁质结合域(chitin binding domain 4,Cht BD4)(148-202),属于CPR家族RR-1亚类。荧光定量分析发现,与Ivf03种群相比,该基因在NIL-R种群中的表达量呈上升趋势,但无显著差异;同一种群不同龄期的表达量差异显著,在一龄若虫期表达量最低,并随着龄期的发育,表达量不断升高且在成虫期的表达量达到最高。4.西花蓟马RNA干扰体系的建立将体外合成的dsRNA与10%花粉溶液混合,通过饲喂的方法将dsRNA导入到西花蓟马体内,并采用实时荧光定量技术检测不同干扰时间后西花蓟马体内目的基因mRNA的表达水平。结果表明西花蓟马取食含dsEGFP或仅为花粉溶液(CK)的饲喂液后在不同时间段内目的基因相对表达量差异不显著,但在12 h-24 h内取食含目的基因ds-RNA的饲喂液后目的基因基因的表达量显著下降,并在干扰24h后目的基因的表达量达到最低,干扰效率可以达到60%以上。
【学位授予单位】：长江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;S433.89
【图文】：

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图 4-1 SgAbd-1-lik 序列分析Figure 4-1Analysis of SgAbd-1-like protein sequence：SgAbd-1-like 的序列分析 Sequence analysis of SgAbd-1-like；方框内为几丁质结合结构域blackbox : chitin binding domain 4, Cht BD4。B：Weblogo 分析 SgAbd-1-like sequence 保守基Analysis of conserved motifs by Weblogo (http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi).3.2 Ivf03 和 NIL 种群 SgAbd-1-lik 基因的序列比较03-103-203-3-1-2-3sensus gGGGGGGaAAAAAAtTTTTTTcCCCCCCgGGGGGGtTTTTTTtTTTTTTcCCCCCCtTTTTTTgGGGGGGtTTTTTTgGGGGGGtTTTTTTgGGGGGGtTTTTTTgGGGGGGcCCCCCCtTTTTTTcCCCCCCgGGGGGGcCCCCCCgGGGGGGgGGGGGGtTTTTTTgGGGGGGgGGGGGGcCCCCCCgGGGGGGCGGGGGcCCCCCCcCCCCCCgGGGGGGtTTTTTTcCCCCCCgGGGGGGcCCCCCCcCCCCCCCCCCGCgGGGGGGcCCCCCCGCCCCCcCCCCCCCCCCCGGGCCCGaAAAAAAcCCCCCCtTTTTTTaAAAAAAcCCCCCCcCCCCCCaAAAAAAcC

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5.2 实验方法.2.1 目的基因 RNAi 干扰引物的设计及 dsRN目的基因 RNAi 干扰引物的设计：以目的基因编码的 siRNA 结合位点网站 http://www.flyrnai.org/cgi-bi花蓟马目的基因 RNAi 干扰引物设计，选择产物长退火温度均在 57°C 左右，筛选出 PairPenalty 较低的上下游引物的 5’端添加 T7 启动子序列-TAATACGA为 ds-1。RNA 干扰引物为：基因名称Gene name引物序列The sequence of图 5-1 西花蓟马 RNAi 装置示意图Figure.5-1 Schematic diagram of RNAinterference dev

【参考文献】