基于分子生物技术的狼蛛摄食分析及控虫效能评价

发布时间：2020-07-13 02:31

【摘要】：本文在国家自然科学基金项目(No.31372159)资助下,以中国农田蜘蛛中的常年优势种——拟环纹豹蛛(Pardosa pseudoannulata)(Araneae:Lycosidae)及其猎物为研究对象,通过宏观与微观相结合的模式,探求了农田蜘蛛在不同环境条件下的摄食行为、消化速率、食谱及其量化控虫效率。采用单因素分析法和三水平三因素正交实验法,对环境照度、颜色和温度等影响拟环纹豹蛛捕食效率的宏观因素进行了分析;应用终点PCR(End-point PCR)、实时荧光PCR(Real-time PCR)、DNA条形码(DNA barcode)、二代测序(Next Generation Sequencing,NGS)和数字PCR(digital PCR,dPCR)等前沿分子生物学手段,从微观角度对拟环纹豹蛛的消化效率、不同生境下的猎物谱进行了测定,并建立了拟环纹豹蛛在农田生态系统中对褐飞虱、灰飞虱、稻纵卷叶螟、麦长管蚜、黑尾叶蝉这五类主要稻田害虫精确捕食量的实验方法,对狼蛛这类天敌在田间不易直接观察统计其捕食种类和数量的难题进行了探讨。主要研究结果总结如下:(1)宏观上,分析了不同环境因素对拟环纹豹蛛捕食猎物效率的影响。单因素实验结果表明,环境条件分别为10 Lx、红色、27℃时狼蛛捕食行为最为活跃。为模拟农田自然生境,采用正交实验L_9(3~3),以判断多种环境因素对狼蛛捕食效率的综合影响。实验结果显示,极差R最大的是环境温度,在优化组合15 Lx-绿色-27℃的条件下拟环纹豹蛛的捕食行为最为活跃,捕食效率最高。由此可见,拟环纹豹蛛的捕食策略和行为与环境因子相适应,是该物种在长期进化过程中与其生存环境不断磨合的结果。(2)微观上,采用终点PCR法检测了拟环纹豹蛛捕食黑腹果蝇后的消化速度,结果显示,当进食16 h后,拟环纹豹蛛消化道内所残留的黑腹果蝇已经很少,24 h后检测不到猎物的残留DNA。随后进一步采用终点PCR法结合实时荧光PCR法两种实验手段,在不同消化时间和消化温度条件下,对拟环纹豹蛛捕食褐飞虱后的衰减/消化效率进行检测。结果显示,捕食后1 h~2 h内拟环纹豹蛛头胸部消化道(吸胃)内褐飞虱DNA残留量相对稳定,2 h后蜘蛛头胸部的吸胃内褐飞虱DNA含量出现衰减,之后其衰减速率不断加快,4 h之后衰减速率趋于平缓;蜘蛛捕食2 h后,褐飞虱体液开始大量进入腹部并消化,消化速率在4 h时最快,但8 h之后趋于平缓。消化温度对拟环纹豹蛛头胸部消化道内褐飞虱DNA含量影响不大,而腹部消化道内褐飞虱DNA含量在26℃时消化速率最快,并随温度升高消化速率逐渐减慢;但结合终点PCR法和实时荧光PCR法结果来看,狼蛛在28℃±2℃的环境条件下都能较好的消化猎物。(3)采用二代测序的方法对湿地、茶园、高山草甸、稻田四种生境中拟环纹豹蛛的天然食性进行了分析。结果表明,在调查样地环境中拟环纹豹蛛以捕食鞘翅目和双翅目昆虫为主,猎物谱极广,此次调查的四种生境中共检测出昆虫纲的7个目、24个科。同时,发现蜘蛛所生存的环境、季节对其食物多样性的影响极大:生境的差异决定了蜘蛛食谱的多样性,蜘蛛猎物食谱丰富度总的趋势为:中低海拔生境高海拔生境;生物群落多样性高的生境群落单一生境;未使用农药的生境使用过农药的生境;湿地旱地;农作物生长中后期收割、换茬期。(4)采用数字PCR技术对拟环纹豹蛛的食性进行定量分析。通过对湖南省农业科研究院未施药稻田进行害虫样本的随机采集,以COI为目标基因设计通用引物,对采集的9类害虫进行了DNA条形码鉴定,检测到该稻田的主要害虫为褐飞虱、灰飞虱、稻纵卷叶螟、麦长管蚜、黑尾叶蝉。在人工干预下,以上述5种害虫为猎物过量喂食拟环纹豹蛛,得到拟环纹豹蛛在24 h内能捕食的最大猎物数。使用数字PCR测得的阳性微滴数对自然条件下采集的拟环纹豹蛛的捕食量进行测算。通过数学建模计算得出,平均每头拟环纹豹蛛捕食了褐飞虱2.64头、灰飞虱2.14头、稻纵卷叶螟0.16头、麦长管蚜1.02头、黑尾叶蝉0.2头。考虑到猎物核酸在蜘蛛消化道内被渐渐降解,导致一些DNA无法进行PCR扩增;以及拟环纹豹蛛天性凶狠,如遇猎物太多,采取先杀死但暂不进食的策略等干扰因素,可见拟环纹豹蛛的实际控虫量应大于本实验的检测值。本研究的特色与创新点是:在蜘蛛领域中首次应用DNA条形码、二代测序和数字PCR技术等前沿分子生物学手段,从微观角度成功列出了不同生境下拟环纹豹蛛的食谱清单,并建立了其在自然状态下控虫效能的评估方法及其数学模型,对传统方法无法全方位检测蜘蛛食谱和精准捕食量的难题进行了探讨。本文研究结果揭示了拟环纹豹蛛在生物控虫中的重要作用,有利于了解生物种群在进化过程中,蜘蛛与其猎物间的演化关系,理论上丰富了蜘蛛学内涵;生产实践上,该研究为在农田生态系统中制定IPM策略提供了新的实用数据;为保蛛控虫提供新的理论依据和科学信息,对减少农药用量,保护生态环境与人类健康有重要意义。
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S476.2
【图文】：

金字塔

图1-1 IPM关键要素的金字塔图Fig 1-1 IPM pyramid showing the most important pest management elements从图1-1[25]中可以看出，IPM金字塔的基础层由非生物元素组成，可以在种植之前或之后施用，并可以持续到收获期。金字塔的中间层可归类为生态元素，其中包含的五个重要元素遵循一个循环体系，并形成了基于生态学的IPM研究基础，其中箭头表示生态元素之间特殊的相互作用。最后，金字塔的顶层为化学杀虫剂，当更多的基础性IPM手段不能将害虫种群控制在阈值以下时，才有必要应用化学杀虫手段。作为IPM的核心环节[25, 26]

狼蛛,论文引用

图1-3 2000年至2018年间狼蛛相关的论文引用量Fig 1-3 The citations of papers related to Lycosidae research between 2000 and 2018图1-4统计了2000年至2018年间发表的狼蛛相关论文的研究方向（来源于WebofScience数据库）。数据显示，自二十一世纪以来，狼蛛在动物学、昆虫学、生态学、行为学和生化及分子生物学这五大领域的研究备受关注，分别占研究总量的26.48%、17.83%、16.46%、12.57%和10.26%。Zoology26.48%Entomology17.83%Ecology16.46%

黑腹果蝇,PCR扩增产物,基因组DNA

基于分子生物技术的狼蛛摄食分析及控虫效能评价27图3-1 黑腹果蝇基因组DNA的PCR扩增产物Fig 3-1 PCR results of Drosophila melanogaster’s DNAM: DNA Marker DS2000; A1~4: 拟环纹豹蛛进食1~4头果蝇后的PCR产物M: DNA Marker DS2000; A1~4: PCR product of feeding 1~4 Drosophilamelanogaster1.3.2PCR 扩增及其对果蝇消化速率测定根据表3-1设定的PCR反应体系，以黑腹果蝇的基因序列为目标片段设计引物，对进食黑腹果蝇后不同时间点的拟环纹豹蛛组织匀浆液进行PCR扩增，电泳结果如图3-2所示：阳性对照有明显扩增条带，大小约为500bp，且无杂带；而阴性对照未扩增出特异性产物，证明PCR实验体系成立。且检测出不同消化时间点的拟环纹豹蛛电泳结果大部分呈阳性，根据Marker条带指示，扩增产物片段的大小均为500 bp左右

【相似文献】