紫色紫孢菌营养胁迫诱导产孢的H3K9表观遗传学机制研究
发布时间：2020-07-21 14:18
【摘要】：分生孢子是丝状真菌普遍的繁殖方式,营养胁迫诱导的产孢是真菌适应环境的重要生存策略[1]。紫色紫孢菌(Purpureocillium lavendulum)是一类重要的线虫生防真菌[2]。前期研究发现该真菌在PDA培养基上培养时菌落生长受限并产生大量孢子,当在PDA中添加真菌基本培养基(MM培养基)中的营养物质后菌落增大。为了研究营养胁迫如何通过表观遗传调控诱导真菌产孢,我们以P.lavendulum △ku80菌株为出发菌株,将紫色紫孢菌中的组蛋白H3上的第九位赖氨酸(H3K9)突变为丙氨酸(A),获得P/H3K9A突变菌株。随后将P/H3K9A突变菌株与△ku80菌株进行表型分析,发现在PDA培养基上,P/H3K9A突变菌株菌落同样增大,产孢量降低。推测紫色紫孢菌在PDA上受一定程度的营养胁迫导致产孢且该过程依赖于表观遗传调控。为了验证这一推测,本研究首先筛选PDA中缺少的营养物质并研究其代谢通路的功能。对P/H3K9进行突变以模拟甲基化或乙酰化等修饰,比较其与△ku80菌株在不同培养基上的表型差异,同时对相应组蛋白修饰酶进行基因敲除,确定何种表观遗传修饰调控该产孢过程。利用转录组分析,获得该调控通路的上下游基因。通过本项目的研究初步阐明营养胁迫如何通过组蛋白H3K9的表观遗传调控诱导真菌产孢,为深入理解食线虫真菌生活史转化的分子机制及线虫的生物防治奠定基础。主要研究结果:1.紫色紫孢菌组蛋白H3K9位点突变构建氯嘧磺隆抗性基因(sur)敲入载体。通过农杆菌介导转化的方法,利用同源重组的原理将我们的筛选标记(sur)敲入至紫色紫孢菌。成功获得sur敲入菌株,结果显示sur基因的表达并未对组蛋白H3,H4的表达量有影响。在此基础上,我们将组蛋白H3的上游片段(含有组蛋白H3片段)与pEASY-Blunt Zero Cloning质粒进行连接,再以此连接载体为模板,对PlH3K9进行不同形式的突变,获得不同形式的的突变质粒,近一步获得PlH3K9A、PlH3K9R、PlH3K9L,PlH3K9Q四种突变菌株。2.构建Pldim5敲除菌株构建氯嘧磺隆抗性基因(sur)敲除载体。通过农杆菌介导转化的方法,利用同源重组的原理将Pldim5基因敲除,成功获得APldim5菌株。3.PlH3K9突变菌株及相关酶基因敲除菌株的表型分析对PlH3K9A、PlH3K9R、PlH3K9L、PlH3K9Q 四种突变菌株,APldim5、APlgCn5菌株及Aku80菌株进行表型分析。经过观察和统计,发现四种突变菌株与两种敲除菌株和△ku80敲除菌株相比,突变菌株与敲除菌株在MM、PDA上生长和产孢不同,而这种不同可以通过向PDA培养基中添加KN03、(NH4)2S04成分得到一定的改善。4.PlH3K9突变菌株及相关酶基因敲除菌株的转绿组分析将不同突变菌株及敲除菌株与△ku80菌株在不同培养基上进行接种培养,收集不少于0.8 g的菌丝。将收集好的菌丝用液氮速冻,进行转录组测序分析。本论文的主要创新点:真菌在营养匮乏的环境中停止生长并产孢是其重要的生存策略,从表观遗传调控的角度探讨饥饿诱导真菌生活史转化的分子机理并未见报道,本研究从组蛋白H3K9突变体出发,通过筛选PDA中营养胁迫的营养物质,点突变模拟组蛋白修饰,转录组等方法试研究组蛋白H3K9介导的营养胁迫诱导产孢的分子机制,为全面理解真菌适应环境胁迫调控生活史转变的生存策略奠定理论基础。
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S476.1
【图文】：
灰称翻抱
ＧＣＮ５是一个保守性较高的蛋白，在酿酒酵母中的同源蛋白为ＧＣＮ５，在构逡逑巢曲霉中为ＧＣＮＥ，在黄曲霉中为ＧＣＮ５，都含有ＧＣＮ５相关的Ｎ－乙酰基转移酶逡逑（ＧＮＡＴ）结构域和Ｃ－末端溴结构域如图１－２所示，列出了不同物种中逡逑ＧＣＮ５的结构域结构。综合以上，我们利用基因组数据，找到紫色紫孢菌中编码逡逑ＧＣＮ５乙酰转移酶的基因并进行预测和功能上的研究。逡逑表１－１不同物种的Ｈ３Ｋ９甲基转移酶逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－１Ｈ３Ｋ９邋ｍｅｔｂｙｉｌｎｉｉｉｓｆｅｒａｓｅｓ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｓｐｅｃｉｅｓ逡逑引自邋Ｌａｃｈｎｅｒ
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本文编号：2764529
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S476.1
【图文】：
灰称翻抱
ＧＣＮ５是一个保守性较高的蛋白，在酿酒酵母中的同源蛋白为ＧＣＮ５，在构逡逑巢曲霉中为ＧＣＮＥ，在黄曲霉中为ＧＣＮ５，都含有ＧＣＮ５相关的Ｎ－乙酰基转移酶逡逑（ＧＮＡＴ）结构域和Ｃ－末端溴结构域如图１－２所示，列出了不同物种中逡逑ＧＣＮ５的结构域结构。综合以上，我们利用基因组数据，找到紫色紫孢菌中编码逡逑ＧＣＮ５乙酰转移酶的基因并进行预测和功能上的研究。逡逑表１－１不同物种的Ｈ３Ｋ９甲基转移酶逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－１Ｈ３Ｋ９邋ｍｅｔｂｙｉｌｎｉｉｉｓｆｅｒａｓｅｓ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｓｐｅｃｉｅｓ逡逑引自邋Ｌａｃｈｎｅｒ
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本文编号：2764529
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