粉棒束孢的主要生物学特性及其响应海拔高度变化的组学分析

发布时间：2020-08-02 18:59

【摘要】：生防真菌在绿色防控的大背景下具有广阔的应用前景,发现一种有效的生防菌对于农业和林业生产都有重要意义。粉棒束孢作为一种虫生真菌,其具有进一步开发为生防菌剂的潜力。与此同时,作为冬虫夏草的定殖真菌,粉棒束孢的生物活性也越来越多地被研究和揭示,粉棒束孢菌丝体也具有规模化生产药物的潜力。这里所用菌株来自于青藏高原的冬虫夏草菌的寄主昆虫,明确菌丝体的生长及其代谢与海拔高度的关系有重要意义,以期为进一步开发利用粉棒束孢提供理论依据。通过对粉棒束孢的主要生物学特性及其菌丝体生产过程中响应海拔高度变化的组学特征的研究,获得的主要结果如下:1.用粉棒束孢接种草原害虫贡嘎勾蝠蛾和农业生产中常见的6种害虫,结果发现,采用浸泡法接种,粉棒束孢对贡嘎勾蝠蛾的感染率极高,证明了贡嘎勾蝠蛾是粉棒束孢的适宜寄主。而采用饲喂法接种,粉棒束孢对蝗虫致死作用不明显。采用浸泡法接种后不吸干水分的方式接种蚜虫、小菜蛾、甜菜夜蛾、棉铃虫和大蜡螟,结果都有不同程度的致死作用;相反,如果采用吸干水分的方式接种,则都无致死效果。2.通过单因素和正交实验的方法筛选出适合粉棒束孢菌丝体液体发酵的营养因素和培养条件,包括葡萄糖,牛肉膏,铁元素,镁元素和7:1的碳氮比,以及应在装有50 mL培养基的250-mL三角瓶中接入10%的菌种,在20℃,12h光照/12h黑暗,120rpm条件下培养。在此基础上,采用液质联用技术进一步比较海拔高度对发酵菌丝体的代谢组影响。结果发现,基于代谢组可以显著区分430 m和2365 m海拔高度的发酵菌丝体。相对于高海拔,低海拔培养的菌丝体有417个代谢物质显著下调,另有631个代谢物质显著上调。代谢物质的显著变化进一步表明,海拔高度是真菌药物质量安全的重要影响因素之一。海拔高度调控物质表达的特性也为促进代谢物质的生产提供了一种新筛选方法。上述结果为进一步使用发酵罐规模化生产质量稳定的粉棒束孢菌丝体提供了理论基础。3.在430 m和2365 m海拔高度的发酵结果表明,粉棒束孢在不同海拔高度的菌丝产量无显著性差异。而转录组信息分析和q-PCR验证结果都表明,高海拔菌丝体呼吸过程中与氧受体相关的基因,如COX5A,QCR8,UQCRFS1,NDUFV1,NDUFA 和NDUFS7的表达都升高。由此推断,粉棒束孢为适应高海拔由有氧呼吸变为厌氧呼吸,会直接导致其自身多消耗一部分能量用于厌氧呼吸过程中呼吸基质的识别与传递;与此同时,与氧受体相关的基因表达显著升高,由此增产的能量可以满足菌丝体厌氧呼吸而增加的能量需求,从而保持呼吸系统的功能稳定,最终保证菌丝产量不变。这可能是粉棒束孢适应海拔变化的转录机制。4.由于菌丝体的代谢受海拔高度显著的调控,为发现相应的调控基因,对在430 m和2365 m海拔高度液体培养的菌丝体进行比较转录组分析,富集到与6个表达差异显著物质对应的代谢通路,并在通路中筛选出具有显著差异表达的基因,建立起代谢物质与基因之间的对应关系。这一结果为进一步揭示基因功能,从而有针对性地构建特殊活性物质的表达载体提供了前期基础。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S476.12
【图文】：

形态特征,蝠蛾幼虫,贡嘎,小菜蛾

２．１实验材料逡逑２．１．１感病材料及供试寄主幼虫逡逑在四川康定冬虫夏草培殖基地生产过程中采集患病的贡嘎勾蝠蛾幼虫（如图２－１Ａ）和健康的逡逑不同龄期的贡嘎勾蝠蛾幼虫。贡嘎勾蝠蛾幼虫的生产方法与专利（尹定华等，２０１２）描述的方法逡逑相同。农业害虫种群有大蜡螺ｗｅ／／ｏ？ｅ／／ａ）、４牙虫（却Ａｉｓ邋ｇ７＿ｙｃｆ？ｅｓ）、幢虫（Ｚｏｃｗｓｔｏｒ逡逑ｍｆｇｒａｔｏｎ＿ａ）、小菜蛾（Ｐ／ｗｔｅ〃ａ；＾／ｏｓｔｅ／／ａ）、棉铃虫（Ｚ／ｅ／ｚ＇ｃｏｖｅｒｐａａ７７？ｎ＇ｇｅｒａ）、菜青虫（Ｐ／ｅ／ｉｙｒａｐａｅ）逡逑和甜菜夜蛾（如ｅ；ａ＾ｗａ）。除健康的大蜡娱种群购自天津惠裕德生物科技有限公司，概虫、逡逑蝗虫、小菜蛾、菜青虫和甜菜夜蛾种群都由中国农业大学生物防治实验室提供。采用谭树乾（２０１６）逡逑的饲养方法准备供试蝗虫，实验之前的所有蝗虫都取食新鲜的室内人工培育的幼嫩小麦麦苗；采逡逑用文献报道（冯明光等，１９９６；单乐天和冯明光，２００６）的方法准备待试蚜虫，试虫全部采用豆蚜逡逑的无翅成蚜，虫龄控制在最后一次蜕皮后不超过２ｄ的龄期；采用文献报道（刘树峰等，２００７）的逡逑方法准备甜菜夜蛾，选取健康且大小一致的３龄甜菜夜蛾幼虫置于带透气孔的塑料培养皿中，以逡逑新鲜的人工配制饲料饲养２￣３ｄ后备用；采用文献报道（刑静等，２０１１）的方法准备小菜蛾，选取逡逑健康且大小一致的３龄小菜蛾幼虫置于塑料培养皿内

序列,分生孢子

大小为１．５？２．５邋ｎｍｘ邋１．３？３．０邋ｎｍ。分生孢子在产孢细胞顶端连接成链状，长者达１〗５隅。逡逑分生孢子链分散，直或弯曲，但绝不互相粘结成圆柱状或球形头状物。分生孢子萌发时膨大成近逡逑球形，直径约３．０邋，产生１？２根芽管（菌丝及产孢结构见图２－２Ａ，孢子见图２－２Ｂ，萌发的分逡逑生孢子见图２－２Ｃ）。完全符合《真菌手册》关于粉棒束孢的特征，因此我们认为所分离的病原菌逡逑为粉棒束孢。逡逑Ａ逦Ｂ逦Ｃ逡逑：丨邋＝：＝：；＝；ｒ：；ｆ邋：：．逡逑图２－２粉棒束孢的分生孢子。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｔｈｅ邋ｃｏｎｉｄｉａ邋ｏｆ邋Ｉｓａｒｉａ邋ｆａｒｉｎｏｓａ．逡逑Ａ：分生孢子梗（张德利等，２０１１）邋；邋Ｂ：分生孢子（张德利等，２０１１）邋；邋Ｃ：萌发的分生孢子。逡逑Ａ：邋Ｔｈｅ邋ｃｏｎｉｄｉｏｐｈｏｒｅ；邋Ｂ：邋Ｔｈｅ邋ｃｏｎｉｄｉｕｍ．邋Ｃ：邋Ｇｅｒｍｉｎａｔｅｄ邋ｃｏｎｉｄｉａ．逡逑２．３．２分子鉴定逡逑表２－２邋ＩＴＳ１序列在ＮＣＢＩ网站上比对结果中位列前１０位的Ｚｓａｒ／ａ加菌株。逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－２邋Ｔｈｅ邋ｔｏｐ邋１０邋ｓｔｒａｉｎｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ｂｌａｓｔ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ＩＴＳ１邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｓｔｒａｉｎ邋ａｎｄ邋ｔｈａｔ邋ｉｎ邋ＮＣＢＩ．逡逑Ｍａｘ逦Ｑｕｅｒｙ逡逑Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ逦Ｔｏｔａｌ邋ｓｃｏｒｅ逦Ｅ邋ｖａｌｕｅ逦Ｉ邋ｄｅｎｔ

基因,软件,分子鉴定,系统发育树

图２－３基于ＴＵＢ基因，采用ＭＥＧＡ６．０软件用ＵＰＧＭＡ构建的系统发育树。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－３邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋ｎｕｃｌｅｏｔｉｃｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ＩＴＳ邋ｇｅｎｅ邋ｂｙ邋ＵＰＧＭＡ邋ｏｆ邋ＭＥＧＡ邋６．０邋ｓｏｆｔｗａｒｅ逡逑在上述分子鉴定的基础上，再综合形态学鉴定结果，证明该病原菌为（粉棒束孢）。逡逑２１逡逑

【参考文献】