转录因子NAC与MADS参与采后枇杷果实冷害木质化调控研究

发布时间：2020-08-23 09:01

【摘要】：枇杷(Eriobotrya japonica)是原产我国的亚热带水果,其采收季节适逢高温,采后果实不耐贮藏物流,低温冷链贮藏物流是延缓采后批杷果实劣变腐烂的主要手段。红肉枇杷'洛阳青'在低温贮藏物流时易罹患生理病害而出现冷害木质化等症状,导致果肉中的木质素含量升高,影响果实商品品质。本研究采用热激(HT)和程序性降温(LTC)等处理,以延缓0℃贮藏过程中的批杷果实木质化进程,结合生物信息学、基因定量、双荧光素酶、酵母单杂交、凝胶迁移率分析(EMSA)、转基因等实验技术手段,研究确定了响应低温冷害的NAC和MADS家族成员,及其参与枇杷果实冷害木质化过程的分子调控机制。研究结果丰富了原有的木质素生物合成转录调控网络。主要结果如下:1.通过转录组数据分析,克隆得到了 6个NAC成员。基因定量实验结果表明,EjNAC3、EjNAC4、EjNAC5C7的表达量在0℃贮藏过程中逐渐上升,与果实冷害木质化进程呈现良好的正相关关系,但只有EjNAC3和EjNAC4显著受到HT以及LTC处理的抑制;而EjNAC6和EjNAC8的表达水平随贮藏时间的延长逐渐下降,与木质化过程呈现负相关关系,且LTC处理在后期能够有效维持EjNAC6的表达水平。此外,通过酵母单杂交文库筛选,以EjMYB8启动子为靶向,筛选获得1个MADS成员,对其在0℃以及LTC条件下的表达模式分析发现,EjMDS1受到LTC处理的显著诱导,且在0℃C贮藏下与果实木质化过程呈现负相关关系。这些结果表明,在转录水平层面上,EjNAC3、EjNAC4和EjMADS1是参与批杷果实木质化的重要候选转录因子。2.研究确定了EjNAC3可直接调控木质素代谢途径结构基因EjCAD-like。双荧光素酶实验发现,EjNAC3蛋白显著激活了EjCAD-like启动子(约6倍),但对于批杷中其他木质素生物合成途径的结构基因效应有限;EjNAC4则暂未找到调控靶标。拟南芥的结构基因中,AtCAD5启动子受到EjNAC3的激活效应最高(约1.5倍)。对EjCAD-like启动子区域的顺式作用元件分析发现了多个NAC蛋白的结合位点。EMSA结果表明,EjNAC3蛋白对-502 bp至-454 bp区域结合作用较强,但对-142bp至-103 bp区域的结合强度较低。酵母单杂实验证明了在体内同样能够实现EjNAC3蛋白与EjCAD-like启动子的直接结合。上述结果表明EjNAC3通过直接作用结构基因的方式参与木质素生物合成调控,其机制有别于传统的次生细胞壁相关NAC成员。3.研究发现了EjMADS1-EjMYB8可形成级联转录效应,参与调控枇杷果实木质化。利用酵母单杂筛库,发现EjMADS1蛋白可以结合参与木质化调控的激活型转录因子EjMYB8的启动子。双荧光素酶实验表明,EjMADS1蛋白可显著抑制EjMYB8启动子活性,但对于其余参与枇杷冷害木质化的MYB成员无显著影响,结合其表达模式与序列结构信息,推测EjMADS1是枇杷果实木质化的抑制型转录因子,并且是首个参与木质化调控的MIKC*亚家族成员。在本实验室前期主要关注木质素合成结构基因Ej4CL1的基础上,本研究发现了 EjNAC3蛋白可直接结合并激活木质素合成结构基因EjCAD-like启动子,参与调控枇杷果实木质化。研究结果丰富了果实木质化过程可被转录调控的靶标基因范畴;同时,在前期转录调控/转录因子复合体研究的基础上,本研究明确了MIKC*亚家族成员EjMADS1可转录调控木质化相关EjMYB8转录因子,在果实木质化研究中引入了级联转录调控模式。研究结果进一步完善了批杷果实采后木质化的转录调控网络。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S667.3;S426
【图文】：

素单体的生物合成途径（Ｖａｎｈｏｌｍｅ等，２０１０）逡逑邋Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ邋ｐａｔｈｗａｙｓ邋ｏｆ邋ｍｏｎｏｌｉｇｎｏｌｓ逡逑素合成的转录调控逡逑式植物中，大量的研究报道了邋ＮＡＣ与ＭＹＢ家族成员介入了次生细质素生物合成的调控，形成了复杂的调控网络（Ｋｕｂｏ等，２００５；邋Ｍｉｔｓｕｄ；邋Ｏｈａｓｈｉ－Ｉｔｏ邋等，２０１０；邋Ｙａｍａｇｕｃｈｉ邋等，２０１１；邋Ｚｈｏｎｇ邋等，２００８）。逡逑道发现ＮＡＣ在木质素单体的聚合中发挥了作用。拟南芥ＳＡ？／邋（ＮＡＣ参与木质素单体的生物合成，也能够直接结合启动子区域元件（ＷＮＮＹＢＴＮＮＮＮＮＮＮＡＭＧＮＨＷ邋）来调控木质素大分子的聚２逡逑

与果实木质化进程呈现负相关关系，表达量持续下降。ＬＴＣ处理能够在一定逡逑程度上维持母Ｍ４Ｃ６的水平表达，并且在贮藏后期，这种差异逐渐放大，达到了逡逑显著程度；ＬＴＣ并未对句Ａ６４ＣＳ在０°Ｃ低温下的表达摸式产生明显影响（图２．２）。逡逑Ｆ逦Ｄ３５逡逑＇邋．ＥＪ１ＷＡＣ３邋ＬＳＤ邋0，＝９．９５邋ＥＪＮＡＣ４邋ＬＳＤ0（）＝６．０９邋．邋３？逡逑Ｉ逦Ｉ邋｜＂0逡逑－“ｌｂ逡逑＾邋ＥｊＮＡＣ５逦ＬＳＤ（１0５＝１．０８邋ＥｊＮＡＣ６邋ＬＳＤｕ（ｌ邋＝０．４５９邋；邋２．５逡逑ｉ逡逑＼４２邋ＥｊＩＷＡＣ７邋ＬＳＤ（0邋＝１．９７邋ＥｊＮＡＣＨ邋ＬＳＤ０（ｔ邋＝０．３８８邋．邋，．５逡逑Ｌ．邋ｉ邋Ｌ邋ｌｌｉｌ邋Ｉ邋ｊ邋ｈ：逡逑０１２３４邋５邋６７８逦０１２３４邋５邋６７８逦■逡逑Ｓｔｏｒａｇｅ邋ｔｉｍｅ邋（ｄ）逡逑图２．２批杷ＮＡＣ家族成员在ＬＴＣ条件下的基因表达模式逡逑标准误由３个生物学重复计算所得。ＬＳＤ代表最小显著差异法（Ｐ＜０．０５）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．２邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｐａｔｔｅｒｎ邋ｏｆ邋ｌｏｑｕａｔ邋ＮＡＣ邋ｇｅｎｅｓ邋ｉｎ邋ｒｅｓｐｏｎｓｅ邋ｔｏ邋ｃｏｌｄ邋（０

２基于转录组的ＮＡＣ家族成员克隆与表达分析逡逑２．２．３邋ＮＡＣ基因在ＨＴ中的基因表达分析逡逑由图２．３可见，与ＬＴＣ处理相似，经ＨＴ处理的所有ＮＡＣ基因表达模式可逡逑大致分为两类，一类是ＥｊＮＡＣ３、ＥｊＮＡＣ４、ＥＪＮＡＣ５与ＥｊＮＡＣ７，它们的表达量被逡逑ＨＴ处理抑制，但仅母ＭＣ？和五与对照存在显著差异；五彡从４０５和逡逑受ＨＴ处理影响不大。分析具有显著差异的两个基因，发现以母凡４Ｃ３的表达量逡逑变化幅度最大，在８ｄ时，表达量仅为对照的１３％左右；而在响应时间方面，逡逑母的表达量在第１邋ｄ时就已明显受到抑制。逡逑６０逦１３５逡逑５0邋ＥｊＮＡＣ３邋ＬＳＤ（）０＝９．８３邋ＥｊＮＡＣ４邋ＬＳＤ（）０邋＝６．６５邋．邋３0逡逑４０邋ＪＨ0°Ｃ逦N逦Ｔ邋Ｔ邋－２５逡逑：ｒ邋ｈｔ逦ＩＬ逦Ｕ逦丨丨逡逑＇0邋．邋Ｌ．邋Ｌ．邋Ｌ邋－ｔ－ｊ＞．邋ｉ．邋Ｉｉ．邋Ｉ邋0逡逑＾邋＾邋ＥｊＮＡＣＳ邋ＬＳＤ00－１．０４邋ＥｊＮＡＣ６邋ＬＳＤ（｜0邋＝０．２９９－邋２．０逡逑４邋？逡逑１邋：ｉｉｉ邋Ｖｉｌ．ｌ邋ｌｉｌｉ．ｌｉ．Ｍ．ｉ＂逡逑＼Ｖ－ＥｊＮＡＣ７邋ＬＳＤ00＝２．０７邋ＥｊＮＡＣ８邋ＬＳＤ邋｜（１邋＝０．４７９＇邋１５逡逑１２逦，Ｍ＊逦１

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本文编号：2801342