朱砂叶螨抗药性相关羧酸酯酶基因鉴定及功能分析

发布时间：2020-08-24 21:46

【摘要】：化学防治一直是保护现代农业生态系统免遭有害生物侵袭的主要方法,而有害生物抗药性也给化学防治带来巨大的挑战。目前,世界上抗药性问题最突出的有害生物是叶螨,它们已经对96种化学农药产生了抗药性。拟除虫菊酯类和线粒体抑制剂类杀螨剂是两类重要的化学杀螨剂,因此研究害螨对拟除虫菊酯类和线粒体抑制剂类杀螨剂的抗药性机制对于两类杀螨剂的长效使用以及害螨抗药性综合治理具有重要意义。本论文以朱砂叶螨为研究对象,全面研究了羧酸酯酶基因对甲氰菊酯抗性和丁氟螨酯抗性形成的作用,鉴定出了抗药性相关的关键酯酶基因,并运用RNAi技术和蛋白表达技术明确了相关酯酶基因的功能,主要研究结果如下:1.生物测定和增效剂实验室内生物测定和增效剂实验结果表明:甲氰菊酯抗性品系(FeR)的抗性倍数为118倍,丁氟螨酯抗性品系(CyR)的抗性倍数为34倍。酯酶抑制剂DEF(脱叶磷,S,S,S-tributyl phosphorotrithioate)显著降低了FeR品系的抗性倍数,却明显提高了CyR品系的抗性倍数,表明酯酶均参与了朱砂叶螨对甲氰菊酯和丁氟螨酯抗药性的形成,但扮演角色不同。2.酯酶粗酶活性检测离体酯酶活性检测结果表明:与SS品系相比,FeR品系和CyR品系体内酯酶活性均显著提高,进一步表明酯酶参与了朱砂叶螨抗药性的形成。3.酯酶基因表达量检测酯酶基因表达模式聚类分析结果显示:FeR抗性品系中存在四条过量表达且积极响应甲氰菊酯胁迫的酯酶基因(TcCCE06、TcCCE13、TcCCE15、TcCCE18),它们被视为参与朱砂叶螨甲氰菊酯抗性形成的关键酯酶基因。CyR品系中存在三条差异表达、能够响应丁氟螨酯胁迫的酯酶基因(TcCCE04、TcCCE12和TcCCE23);与FeR品系不同的是,上调酯酶基因(TcCCE04)受到丁氟螨酯胁迫后进一步上调而下调酯酶基因(TcCCE12和TcCCE23)在丁氟螨酯的胁迫下进一步下调,暗示出酯酶基因通过上调和下调的协同作用,促进朱砂叶螨丁氟螨酯抗药性的形成。4.RNAi验证关键酯酶基因体内功能RNAi干扰结果表明:甲氰菊酯抗性相关酯酶基因被沉默后(SS品系的沉默效率55-73%,FeR品系的沉默效率50-69%),SS品系体内酯酶活性降低了0.34-0.44倍,FeR品系体内酯酶活性降低了0.25-0.3倍;FeR品系对甲氰菊酯的抗性倍数也明显下降,其中,TcCCE06基因对FeR抗性倍数的影响最大(由118.5倍降至106.3倍),被选为后续功能研究的代表基因;丁氟螨酯抗性相关酯酶基因同样被有效沉默(SS品系的沉默效率64-80%,CyR品系的沉默效率55-64%),但沉默TcCCE04基因未显著改变朱砂叶螨对丁氟螨酯的敏感性,表明此基因与丁氟螨酯抗性形成关系不大;沉默TcCCE12和TcCCE23基因后,CyR品系对丁氟螨酯的抗性倍数从18.96倍降低至1.14倍和1.14倍,表明这2条下调酯酶基因可能对丁氟螨酯抗药性的形成具有重要作用。5.蛋白表达验证关键酯酶基因体外功能蛋白表达结果表明:甲氰菊酯抗性相关酯酶基因TcCCE06和丁氟螨酯抗性相关酯酶基因TcCCE12成功表达出活性蛋白,它们对酯酶特异底物1-NA(1-萘酚乙酯,273.5μM)的活性分别为22.6 nM/min/mg和128 nM/min/mg。甲氰菊酯能够竞争性抑制重组蛋白TcCCE06酯酶的活性,其IC_(50)为146.8μM;丁氟螨酯能够竞争性抑制TcCCE12酯酶的活性,其IC_(50)为97.9μM。此外,重组蛋白TcCCE06酯酶能够在3h内代谢41.79%的甲氰菊酯;重组蛋白TcCCE12酯酶能够在3h内代谢36.9%的丁氟螨酯,并伴有水解产物含量升高的结果。6.可变剪接可能是改变基因表达量的一种途径本研究首次发现羧酸酯酶基因存在可变剪接现象。TcCCE23基因具有三个外显子和两个内含子,其可变剪接发生于第一外显子末端,可变剪接序列具有GT-AG特征,长度为18bp,属于常见的5’可变剪接类型。此基因的两条变体(V1和V2)存在于朱砂叶螨SS,CyR和FeR品系中,不同品系基因变体序列无差异,但是它们的表达量却存在显著差异:FeR品系体内TcCCE23-V2的含量(93%)显著高于SS品系(71%)和CyR品系(73%),暗示出TcCCE23-V2含量的提高可能与甲氰菊酯抗药性形成有关。RNAi基因功能验证结果也证实了TcCCE23-V2表达量变化可影响朱砂叶螨对甲氰菊酯的敏感性。除增加基因拷贝数和提高转录效率外,酯酶还可以通过可变剪接提高特异基因变体表达量参与抗药性的形成。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S433
【图文】：

人类目前没有(也不可能有)万灵的害虫防治策略。害虫具有适应各类人工防治方法的能力，无论是生物防治，化学防治，基因工程防治还是 RNAi 防治，其对人工防治策略产生抗性是一种自然的结果[44]。同样，没有哪种农药会永久有效，生物(不仅局限于害虫)抗药性是基因多样性的一种表现形式，所以害虫抗药性无法根除且一直会是化学防治的重大挑战，因此持续关注和深入研究害虫害螨抗药性机制显得尤为重要。1.3 害虫/螨抗药性机制1.3.1 靶标抗性靶标抗性是指害虫基因序列改变导致靶标部位对药剂敏感性降低而引起的抗药性。害虫一旦获得靶标突变，便会永久对一(多)种药剂甚至一(多)类药剂产生抗药性，且此抗性不能被农药增效剂抑制，被认为是危害最严重的一种抗药性机制[45]。目前大部分杀虫杀螨剂的作用靶标已经被鉴定出来，如拟除虫菊酯类、DDT 和三氯杀螨醇的作用靶标是电压门控离子通道(para)[45-47]；有机氯类和苯吡唑类药剂的作用靶标是 GABA 门控离子通道(Rdl)[48, 49]；有机磷类和氨基甲酸酯类农药的作用靶标是乙酰胆碱酯酶(ace)[50, 51]等。现有杀虫杀螨剂的作用形式主要包括 4 种类型：干扰神经传递，抑制线粒体电子传递链，控制生长发育和扰乱肠道功能[37]。有些农药的作用靶标在螨和昆虫中的相同，也有些作用靶标具有种属特异性，这些特异性靶标位点为开发选择性杀虫杀螨剂提供了理论依据。

抗农药原药数量的排名op resistant arthropods, based on the number of unique actien documented and the number of cases presented.倍体)[68]。笔者注意到部分文献里的螨生活史的示意育阶段，而实际上雄螨的前一个阶段是第一若螨，而生活史示意图做了修正(图 3)。叶螨这种独特的生殖方，因为雄性个体可以在种群中迅速传播显性基因，导致基因组也为抗性遗传和机理研究提供了很大的便利[12想模型。

第一章 文献综述背景和意义 (Tetranychus cinnabarinus) 属 于 蛛 形 纲 (Arachnida), 蜱 螨叶螨总科(Tetranychoidae)，叶螨科(Tetranychidae),是一种重要螨的防治多依赖于化学杀螨剂，但由于其世代周期短，繁殖药性问题比其他农业害虫(螨)更为突出[136, 137]。笔者所外种群已经对甲氰菊酯产生了较高水平的抗药性[138]。我们性品系存在 kdr 突变(F1538I)，可能是介导甲氰菊酯抗性形，三大解毒酶 P450s、GSTs 和 CCEs 也在朱砂叶螨甲氰菊酯抗

【参考文献】

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1 吴孔明,刘孝纯,秦夏卿,娄国强;朱砂叶螨抗药性研究[J];华北农学报;1990年02期

本文编号：2802900