四种重要植物病原物恒温扩增检测技术的建立

发布时间：2020-08-31 09:54

　　黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)和黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是危害葫芦科作物的两种常见病原物;李属坏死环斑病毒(Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)、李痘病毒(Plum pox virus,PPV)是核果类果树的重要病原物。其中,黄瓜绿斑驳花叶病毒、李属坏死环斑病毒、李痘病毒是我国出入境检疫性有害生物。随着国内、国际贸易的迅猛发展,检疫性病原物进入我国的风险逐渐提高。基于此,本研究针对上述四种病原物,利用交叉引物恒温扩增检测技术和重组酶聚合酶等温扩增技术建立了快速准确的病原物检测方法,主要结果如下:1.建立黄瓜细菌性角斑病菌交叉引物恒温扩增检测技术根据黄瓜细菌性角斑病菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因,设计并筛选特异性引物,建立了黄瓜细菌性角斑病菌交叉引物恒温扩增检测技术,可区分黄瓜细菌性角斑病菌和13种常见的假单胞及其他菌属致病菌,检测限为0.54×10~3 CFU/mL。2.建立黄瓜绿斑驳花叶病毒交叉引物恒温扩增检测技术根据黄瓜绿斑驳花叶病毒基因组中3'端外壳蛋白基因序列,设计并筛选特异性引物,建立了黄瓜绿斑驳花叶病毒交叉引物恒温扩增检测技术,可区分黄瓜绿斑驳花叶病毒和其他5种葫芦科作物常见病毒(黄瓜花叶病毒、辣椒轻斑驳病毒、烟草花叶病毒、番茄花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒),检测限为24.3 ng/μL总RNA。3.建立李属坏死环斑病毒交叉引物恒温扩增检测技术根据李属坏死环斑病毒外壳蛋白基因序列,设计并筛选特异性引物,建立了李属坏死环斑病毒交叉引物恒温扩展检测技术,可区分李属坏死环斑病毒和李属植物的其他常见病毒(李痘病毒、苹果花叶病毒、南芥菜花叶病毒)及类病毒(苹果锈果类病毒、桃潜隐花叶类病毒),检测限为72个拷贝。4.建立李痘病毒重组酶聚合酶恒温扩增检测技术根据李痘病毒全基因组中外壳蛋白基因序列设计并筛选特异性引物,建立了李痘病毒重组酶聚合酶恒温扩增检测技术,可以区分李痘病毒与其他3种马铃薯Y属病毒(马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒、小西葫芦黄花叶病毒),以及常见的李属植物病毒(李属坏死环斑病毒、苹果花叶病毒、南芥菜花叶病毒)与类病毒(苹果锈果类病毒、桃潜隐花叶类病毒),检测限为0.53 ng/μL总RNA。本研究基于两种恒温扩增技术,分别建立四种重要病原物的恒温扩增检测技术。这些检测方法可以在恒温条件下完成对目的核酸片段的扩增,具有快速、特异、灵敏度高、操作简单等优点,避免了常规检测方法需要昂贵仪器、费时等缺点,在口岸检疫和田间检测中具有重要应用价值,对于保护葫芦科和李属作物的生产具有重要意义。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S432.4
【部分图文】：

黄瓜细菌性角斑病

第一章引言1.1 病原物概述1.1.1 黄瓜细菌性角斑病菌黄瓜细菌性角斑病病原菌为丁香假单胞黄瓜致病变种（Pseudomonas syringae pv.Lachrymans）(Olczakwoltman et al., 2007)。黄瓜细菌性角斑病菌基因组大小约为 6.5 Mb，包含一个环状的染色体 DNA 和两个单独的质粒 DNA(Buell et al., 2003)。该病菌为革兰氏阴性菌，具有单极生鞭毛，菌体呈短杆状，不耐酸，生长温度喜 25-28℃，湿度喜 75%以上，最适酸碱度为 PH6.8(刘延英, 2003)。黄瓜细菌性角斑病是黄瓜生产上的重要病害之一，分布广且为害严重，在世界各地均有发生(孙福在 et al., 1988; 张吉光 et al., 2010)。黄瓜细菌性角斑病菌可通过灌水、气流、风雨，昆虫和农事操作等由气孔、伤口侵入寄主。种植密度过大时，农事操作易使叶片摩擦造成伤口，因此，在温暖多雨条件下的连作田极易发病(李宝栋 2001)。染病初期的植株叶片呈现黄色褪绿斑点，叶背病斑为水浸状，染病后期在叶脉阻隔下病斑呈现不规则多边形(图 1.1)，之后病斑开裂，叶片干枯脱落(刘春艳 et al., 2010)。黄瓜细菌性角斑病菌症状与黄瓜霜霉病症状相似，在防治过程中极易混淆(蔡江文 et al., 2008; 王平 et al., 2012)。

侵染,黄瓜,症状,绿斑

论文，之后变成花叶，叶片凹凸不平，卷曲，并带有浓绿色的（图 1.2）。侵染后的西瓜种苗，果实表面有浓绿色圆斑，果浸状，种子周围果肉呈紫红色水浸装，果肉中黄色纤维明显品质下降，几乎不能食用，同时产量严重下降，对瓜类作物V 随着进口瓜类种子传入我国，使得多个地区的葫芦科作绿斑驳花叶病毒主要通过种子进行传播，其他受污染的农具瓜绿斑驳花叶病毒活力稳定，移栽，授粉等农事操作均可造有效的途径是进行严格检疫，切断传染源(郑丽娇 2010)。

玫瑰,侵染,症状,环斑

图 1.3 PNRSV 侵染玫瑰症状Fig. 1.3 Symptom of rose leaves infected by PNRSV(Salarejczak et al., 2005)毒Plum pox virus, PPV）属于马铃薯 Y 病毒属（Potyvirus），病毒粒子呈弯11 nm，病毒基因组含有一条单链 RNA，约 10,000 个寡核苷酸(Maiss2008)。李痘病毒是核果类果树的重要危害病毒之一，可侵染杏、桃、其侵染的果树叶片扭曲，出现褪绿环斑，叶脉黄化，果皮上出现环斑果实未成熟的时候大量脱落，产量降低，造成严重的经济损失(洪健 et 8)。自然条件下，李痘病毒会经蚜虫进行传播，染病繁殖材料的运输是原因(Wallis et al., 2005; 杨雷亮 et al., 2008)。李痘病毒目前在欧洲，

【参考文献】