黑磷对细菌的毒性和对土壤酶活性及其细菌多样性的影响
发布时间：2020-09-01 12:46
黑磷(BP)作为新型二维材料以其优异的性能在许多领域有着广阔的应用前景,目前以有报道发现BP可以抑制细胞生长,但它对环境的影响尚未得到足够的重视。本研究以黑磷块为研究原料,通过超声剥离法对其进行剥离获得BP纳米片,从BP纳米片对纯培养细菌的毒性、对土壤酶活及其土壤细菌多样性和丰度的影响等角度,探究了BP对细菌的生物毒性。在BP的细菌毒性实验中,选择革兰氏阳性菌B.subtilis和革兰氏阴性菌E.coli作为受试对象,添加不同浓度的BP(0μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL),探究BP对纯培养细菌的毒性及毒性产生原因。通过监测细菌生长曲线及平板涂布两种方法发现,BP可以有效的抑制纯培养细菌的生长,处理6 h时,BP对革兰氏阴性E.coli的毒性比革兰氏阳性B.subtilis高,但对E.coli所表现出的毒性在12 h时显著降低。BP所表现出的细菌毒性呈浓度依赖性,对B.subtilis还具有时间依赖性,暴露12 h后BP对E.coli和B.subtilis的最大杀菌效率分别为88.76%和99.69%。通过探针标记和SEM电镜观察,发现BP通过在细菌内部产生活性氧自由基(ROS)和破坏细胞的完整性这两种方式抑制细菌生长。在土壤实验中,添加不同浓度BP(0 mg/kg、10 mg/kg、50 mg/kg),以有机质含量较高的黑土和有机质含量相对较低的棕壤作为受试对象,通过探究BP在不同土壤类型中对土壤酶活和细菌多样性的影响我们发现,在土壤酶活方面,在黑土培养初期(10d),不同浓度BP均表现出抑制土壤脲酶活性、促进了过氧化氢酶活性的趋势,随浓度增大作用效果增强,但差异不显著,培养到30 d时,黑土中土壤酶活性相继恢复,整个培养过程中添加不同浓度BP处理对土壤脲酶,过氧化氢酶以及酸性磷酸酶活性影响差异不显著;在棕壤培养初期(10d),不同浓度BP显著的抑制了棕壤脲酶活性,同时显著促进了过氧化氢酶活性,且均有浓度依赖性,培养30 d后其不同土壤酶活性同样开始恢复,整个过程中对中性磷酸酶影响差异不显著;对比BP在两种土壤中对酶活的影响发现,棕壤的土壤酶活对BP的响应比黑土的敏感。在pH变化方面,和空白土壤样本相比,BP可以显著降低棕壤培养末期(60d)的pH值,但对黑土的pH值影响差异不显著。基于高通量测序结合qPCR技术研究BP对土壤细菌多样性和丰度的影响,结果表明,添加BP可以降低两种土壤细菌丰富度,在培养初期(10 d)对棕壤影响较为显著,但在培养后期影响差异不显著;整个培养过程中,BP对黑土细菌丰富度影响差异不显著;BP在培养初期可以促进黑土中放线菌门的生长,在培养末期酸杆菌门相对丰度在处理样本中显著高于空白样本,而BP对棕壤中拟杆菌门的生长具有抑制作用。属水平上,BP可以促进土壤中部分磷代谢微生物活性,如假单胞菌属、芽单胞菌属等。在细菌丰度中,BP在不同时期对细菌丰度影响差异不显著。通过试验发现,50 mg/kg的BP添加量不会明显改变土壤细菌群落多样性。综上所述,BP可以通过ROS介导的氧化应激和破坏细胞膜完整性两方面共同作用对革兰氏阴性菌E.coli和革兰氏阳性菌B.subtilis造成毒性;在土壤酶活方面,BP可以显著抑制棕壤土壤脲酶,促进过氧化氢酶酶活性,并表现出浓度依赖性,由于黑土有机质含量较高,BP对黑土土壤酶活影响差异不显著;在细菌多样性方面,50 mg/kg的BP添加量可以显著降低初期棕壤土壤细菌丰富度,而整个培养过程中对到黑土土壤细菌多样性影响差异不显著。
【学位单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S154
【部分图文】：
3 结果与分析3.1 黑磷对纯培养细菌生物毒性微生物广泛存在与环境，参与环境中不同代谢循环[69]。通过研究 BP 对纯培养微生的毒性行为，可以更好的评价 BP 在环境中的生物学效应。E.coli 广泛存在于环境中，且被作为模式菌株用于指示不同材料的生物学毒性[70, 71]，因此我们选取革兰氏阴性菌 E.c及同为杆状细菌的革兰氏阳性菌 B. subtilis 作为受试对象，探究 BP 的微生物毒性。3.1.1 黑磷的剥离及表征在无氧水中通过超声剥离法成功制备 BP 纳米片，如显微镜图像所示(图 3-1 a-c)，剥的 BP 纳米片分散良好，通过 AFM 结果进行统计分析可知，所剥离获得 BP 的平均宽度厚度分别为 215.84 ± 82.09 和 1.58 ± 1.23 nm(图 3-1 f,g)。通过 DLS 分析发现，所制备 的平均粒径大小为 214 nm，表面电位为-17 mv (图 3-1 d,e)。
图 3-2 不同浓度对的细菌毒性 E. coli (a)和 B. subtilis (b)在暴露在不同浓度 BP 下，37 °C 下培养 12 h 的生长曲线以及 BP 对 E. coli (c)和 B. subtilis (d)在 6h 和 12h 的抑制率(*和***分别表示 P < 0.05 和 P <0.001)Figure 3-2 Bacterial toxicity of different concentrations of BP nanosheets. Growth curve of E. coli (a) and B.subtilis (b) exposed to different concentrations of BP nanosheets at 37 °C for 12 h in LB medium; Theinhibition rate of BP nanosheets against E. coli (c) and B. subtilis (d) at 6 h and 12 h (* and *** indicate P <0.05 and P < 0.001, respectively)为了进一步探究 BP 对细菌的毒性效果，采用平板涂布法研究 BP 对活细菌的杀菌效果(图 3-3)。从图中可以清晰的发现，随着 BP 浓度的增加，两种细菌通过平板涂布所得菌落数明显减少(P < 0.01)。BP 的杀菌效果和生长曲线表现出一致的规律，对于 E. coli 在 6 h暂时表现出较强的杀菌效果，高浓度下杀菌率分别为 90.77 ± 0.39% (50 μg/mL)和 98.92 ±0.16% (100 μg/mL)，在培养 12 h后，BP 的杀菌效果降低至71.87 ± 2.88% (50 μg/mL)和91.65± 2.14% (100 μg/mL) (图 3-3 i)。对比 E. coli，从 B. subtilis 的结果我们可以发现，BP 对与 B.
图 3-3 不同浓度黑磷的杀菌效率 0 μg/mL (a, e, j, n), 10 μg/mL (b, f, k, o), 50 μg/mL (c, g, l, p)和 100μg/mL (d, h, m, q)浓度下的 BP 处理 E. coli (a-h)和 B. subtilis (j-q)所得 6 h (a-d, j-m)和 12 h (e-h, n-q)的平板照片以及 BP 对 E. coli (i)和 B. subtilis (r)杀菌效率统计(**和***分别表示 P < 0.01 和 P < 0.001)Figure 3-3 The concentration-dependent bactericidal effects of BP nanosheets after 6 and 12 h treatment.Photographs of agar plates of E. coli (a-h) and B. subtilis (j-q) after incubation with 0 μg/mL (a, e, j, n), 10μg/mL (b, f, k, o), 50 μg/mL (c, g, l, p), and 100 μg/mL (d, h, m, q) of BP nanosheets. The bactericidalefficiency of BP nanosheets towards E. coli (i) and B. subtilis (r) calculated from colony counting. (** and ***indicate P < 0.01 and P < 0.001, respectively)通过测定 BP 在 OD 600 nm 处吸光度绘制 BP 的降解曲线(图 3-4)，从图中我们可以发现，BP 在 600 nm 处的吸光度随时间进行而呈现下降趋势，这也进一步解释了 BP 在培养前所产生毒性较强而后期其毒性降低。
【学位单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S154
【部分图文】：
3 结果与分析3.1 黑磷对纯培养细菌生物毒性微生物广泛存在与环境，参与环境中不同代谢循环[69]。通过研究 BP 对纯培养微生的毒性行为，可以更好的评价 BP 在环境中的生物学效应。E.coli 广泛存在于环境中，且被作为模式菌株用于指示不同材料的生物学毒性[70, 71]，因此我们选取革兰氏阴性菌 E.c及同为杆状细菌的革兰氏阳性菌 B. subtilis 作为受试对象，探究 BP 的微生物毒性。3.1.1 黑磷的剥离及表征在无氧水中通过超声剥离法成功制备 BP 纳米片，如显微镜图像所示(图 3-1 a-c)，剥的 BP 纳米片分散良好，通过 AFM 结果进行统计分析可知，所剥离获得 BP 的平均宽度厚度分别为 215.84 ± 82.09 和 1.58 ± 1.23 nm(图 3-1 f,g)。通过 DLS 分析发现，所制备 的平均粒径大小为 214 nm，表面电位为-17 mv (图 3-1 d,e)。
图 3-2 不同浓度对的细菌毒性 E. coli (a)和 B. subtilis (b)在暴露在不同浓度 BP 下，37 °C 下培养 12 h 的生长曲线以及 BP 对 E. coli (c)和 B. subtilis (d)在 6h 和 12h 的抑制率(*和***分别表示 P < 0.05 和 P <0.001)Figure 3-2 Bacterial toxicity of different concentrations of BP nanosheets. Growth curve of E. coli (a) and B.subtilis (b) exposed to different concentrations of BP nanosheets at 37 °C for 12 h in LB medium; Theinhibition rate of BP nanosheets against E. coli (c) and B. subtilis (d) at 6 h and 12 h (* and *** indicate P <0.05 and P < 0.001, respectively)为了进一步探究 BP 对细菌的毒性效果，采用平板涂布法研究 BP 对活细菌的杀菌效果(图 3-3)。从图中可以清晰的发现，随着 BP 浓度的增加，两种细菌通过平板涂布所得菌落数明显减少(P < 0.01)。BP 的杀菌效果和生长曲线表现出一致的规律，对于 E. coli 在 6 h暂时表现出较强的杀菌效果，高浓度下杀菌率分别为 90.77 ± 0.39% (50 μg/mL)和 98.92 ±0.16% (100 μg/mL)，在培养 12 h后，BP 的杀菌效果降低至71.87 ± 2.88% (50 μg/mL)和91.65± 2.14% (100 μg/mL) (图 3-3 i)。对比 E. coli，从 B. subtilis 的结果我们可以发现，BP 对与 B.
图 3-3 不同浓度黑磷的杀菌效率 0 μg/mL (a, e, j, n), 10 μg/mL (b, f, k, o), 50 μg/mL (c, g, l, p)和 100μg/mL (d, h, m, q)浓度下的 BP 处理 E. coli (a-h)和 B. subtilis (j-q)所得 6 h (a-d, j-m)和 12 h (e-h, n-q)的平板照片以及 BP 对 E. coli (i)和 B. subtilis (r)杀菌效率统计(**和***分别表示 P < 0.01 和 P < 0.001)Figure 3-3 The concentration-dependent bactericidal effects of BP nanosheets after 6 and 12 h treatment.Photographs of agar plates of E. coli (a-h) and B. subtilis (j-q) after incubation with 0 μg/mL (a, e, j, n), 10μg/mL (b, f, k, o), 50 μg/mL (c, g, l, p), and 100 μg/mL (d, h, m, q) of BP nanosheets. The bactericidalefficiency of BP nanosheets towards E. coli (i) and B. subtilis (r) calculated from colony counting. (** and ***indicate P < 0.01 and P < 0.001, respectively)通过测定 BP 在 OD 600 nm 处吸光度绘制 BP 的降解曲线(图 3-4)，从图中我们可以发现，BP 在 600 nm 处的吸光度随时间进行而呈现下降趋势，这也进一步解释了 BP 在培养前所产生毒性较强而后期其毒性降低。
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本文编号：2809752
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