杀真菌链霉菌（Streptomyces fungicidicus）代谢产物的分离纯化及结构鉴定

发布时间：2020-09-03 09:17

　　 放线菌是一类重要的微生物资源,能产生丰富具有活性的次级代谢产物,这些物质在植物病害生物防治方面具有广泛的应用。本实验室通过前期筛选,获得了一株具有自主知识产权的杀真菌链霉菌(Streptomyces fungicidicus),其发酵液对植物病原真菌具有很好的防治效果,本文围绕发酵液中抑菌活性物质的分离纯化及结构解析展开深入研究,获得以下结果:该链霉菌经液体培养基发酵培养后,通过离心、滤膜过滤去除菌丝体和培养基组分,收集发酵液,用XAD-16大孔树脂对发酵液中活性物质进行吸附,然后用50%甲醇浸泡树脂,经二氯甲烷萃取,收集二氯甲烷相,浓缩后获得3.1 g粗提物浸膏。对粗提物进行一级硅胶柱层析,共获得15个不同组分,编号为1~15。以烟草赤星病菌(Alternaria alternata)为指示菌,采用杯碟法对这15个组分进行活性测定,其中有6个组分有活性,用十字交叉法分别测量抑菌圈直径大小,3号和6号组分的抑菌圈直径最大,分别为37.2 mm和30.8 mm。3号组分经二级硅胶柱层析,Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析,获得一个化合物A3,并通过薄层层析检测,该物质在硅胶板上成单一的色谱点,通过分析型高效液相进行分析,在第19 min时出现了一个单一的峰,判断该物质为单体化合物。6号组分经过制备型高效液相色谱反复制备分离,共获得了4个单体化合物,F1、F2、F3和F8。采用核磁共振、质谱等多种结构鉴定方法对上述五个单体化合物进行结构鉴定。结合谱图检测数据和相关文献数据,确定这5个化合物中,A3、F1、F2和F3为已知化合物,分别是:邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl Phthalate)、环(苯丙氨酸-脯氨酸)二肽(Cyclo-(Phe-Pro))、环(脯氨酸-亮氨酸)二肽(Cyclo-(Pro-Leu))、环(脯氨酸-异亮氨酸)二肽(Cyclo-(Pro-Ile));通过SCI Finder数据库查找,发现没有与F8结构一致的化合物,因此将化合物F8鉴定为新的天然产物,将其命名为6-(5-hydroxy-6-methylheptyl)-5,6-dihydro-2H-pyran-2-one。采用96孔板微量稀释法对5个化合物抗植物病原真菌活性进行研究,结果表明,5个化合物均有抗烟草赤星病菌活性,且化合物A3和F8的抑菌活性较好,其IC_(50)分别为22.9μg/mL和20.8μg/mL。此外,这也是该类化合物在防治烟草赤星病害上的首次报道。通过单因子试验明确了链霉菌发酵培养基中最适碳源和氮源,分别是淀粉和花生饼粉。利用Plackett-Burman试验筛选出培养基中对活性物质产生影响较大的成分,分别是淀粉和硫酸铵;同时利用响应面法,选取淀粉、花生饼粉和硫酸铵这三个因素进行Box-Behnken实验设计,通过多元回归分析,得到三种成分优化后的浓度分别为,淀粉27.15 g/L,花生饼粉27.88 g/L,硫酸铵0.72 g/L,优化后的发酵液抑菌圈直径的平均值为33.05 mm,较优化之前提高了31.2%。利用简并引物,对链霉菌进行Ⅰ型聚酮合酶(PKS-Ⅰ)、Ⅱ型聚酮合酶(PKS-Ⅱ)和非核糖体肽合成酶(NRPS)功能基因的扩增,评估其可能产生的次级代谢产物的类别,结果表明,该菌株分别含有PKS-Ⅰ和NRPS相关基因,具有催化产生聚酮类化合物和非核糖体肽类物质的潜力。
【学位单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S476.1
【部分图文】：

2-1 菌株液体发酵上清液对烟草赤星病菌的抑制g.2-1 Inhibition of the liquid fermentation on A.alte菌株粗提物的制备和抑菌活性测定发酵培养，通过离心、滤膜过滤去除菌丝对发酵液中活性物质进行吸附，收集树脂蒸发仪进行浓缩，共获得粗提物的总的浸行反复萃取，获得 3.1 g 粗提物。采用牛津菌活性，共三次重复，具体结果如下图 2无菌水粗提物

图 2-1 菌株液体发酵上清液对烟草赤星病菌的抑制作用Fig.2-1 Inhibition of the liquid fermentation on A.alternate菌菌株粗提物的制备和抑菌活性测定行发酵培养，通过离心、滤膜过滤去除菌丝体和脂对发酵液中活性物质进行吸附，收集树脂，甲转蒸发仪进行浓缩，共获得粗提物的总的浸膏 2进行反复萃取，获得 3.1 g 粗提物。采用牛津杯抑菌活性，共三次重复，具体结果如下图 2-2。上清液 无菌水

图 2-3 菌株粗提物薄层层析检测结果Fig.2-3 The TLC results of crude extraction2.2.4 粗提物一级硅胶柱层析分离和各组分薄层层析检测根据对粗提物薄层层析的结果，试验选用二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂，采用梯度洗脱法，共进行了 6 个梯度的洗脱，共收集 40 个样品。它们分别是 A1~8、B1~8、C1~8、D1~8、E1~7、F，将粗提物作为对照，与这 40 个样品一起进行薄层层析，结果如下：

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本文编号：2811244