CYP3A4介导的叶菌唑与氟苯嘧啶醇立体选择性代谢研究

发布时间：2020-09-04 16:23

　　 三唑类和嘧啶醇类杀菌剂作为两种广泛使用的手性杀菌剂,目前已在多种环境介质中检测到残留超标,生态安全事故频发。然而关于人CYP3A4酶介导的三唑类和嘧啶醇类杀菌剂立体选择性代谢研究匮乏,分子作用机制亦不明确。本文选取叶菌唑、氯/氟苯嘧啶醇为目标化合物,分离制备了对映体,进行了关于CYP3A4酶介导代谢的立体选择性研究,从与CYP3A4酶相互作用角度,诠释了这两类杀菌剂的代谢立体选择差异性的分子机制。主要获取的结果和结论如下：(1)采用高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)成功分离和制备了叶菌唑四个单一手性异构体,并利用圆二色光谱仪(Circular Dichroism, CD)和含时密度泛函理论(Time-dependent Density Functional Theory,TDDFT)鉴定了各对映体的绝对化学构型。(2)选取叶菌唑cis-RS和cis-SR两种单体,研究了人肝微粒体(Human Liver Microsome, HLM)和CYP3A4酶介导的代谢的立体选择性差异,发现叶菌唑能被HLM和CYP3A4酶降解,其中,CYP3A4酶为叶菌唑的主要代谢酶,其对叶菌唑的降解率遵循cis-RScis-SR.代谢过程中,对映体分数(Enantiomer Fraction, EF)由0.5逐渐增大到0.82,表明cis-RS能优先被CYP3A4酶代谢,存在显著的对映体选择性差异。(3)针对氯/氟苯嘧啶醇进行了人CYP3A4酶介导的体外代谢研究,发现氯苯嘧啶醇和氟苯嘧啶醇均能被CYP3A4酶代谢。氟苯嘧啶醇代谢速率大于氯苯嘧啶醇。氯苯嘧啶醇降解率与时间不成规律性变化,代谢无明显对映体差异；氟苯嘧啶醇代谢具有一定立体选择性差异,R型-氟苯嘧啶醇能优先被CYP3A4酶降解,并且代谢具有显著时间依赖性。(4)采用CYP3A4 Glo荧光素酶检测技术分析了叶菌唑单体对人CYP3A4酶的活性影响。通过荧光光谱技术在分子水平上研究了叶菌唑对映体单体与人CYP3A4酶结合后诱导的CYP3A4酶的构象变化,比较了不同单体结合力强弱。从相互作用角度分析了CYP3A4酶介导的叶菌唑的立体选择性代谢差异。叶菌唑是CYP3A4酶的强抑制剂,抑制效果具有浓度依赖性并遵循cis-SRcis-RS。叶菌唑对映体cis-RS和cis-SR与CYP3A4酶结合模式各异,对CYP3A4蛋白结构微环境产生的影响不同,可能引起蛋白功能破坏程度的差异。(5)从分子间相互作用角度分析了氯/氟苯嘧啶醇与CYP3A4酶的作用机制。酶活性检测发现氯/氟苯嘧啶醇是CYP3A4酶的抑制剂,抑制效果遵循S-氟苯嘧啶醇R-氯苯嘧啶醇S-氯苯嘧啶醇R-氟苯嘧啶醇。荧光光谱法结合分子对接证实了氯/氟苯嘧啶醇会导致CYP3A4酶微观结构的改变。氯/氟苯嘧啶醇对映体与CYP3A4酶的相互作用力主要为氢键和范德华力,但作用强度有所差异,顺序分别为R-氯苯嘧啶醇S-氯苯嘧啶醇和S-氟苯嘧啶醇R-氟苯嘧啶醇。(6)通过酵母双杂实验(Yeast Two-hybrid Assay)发现叶菌唑和氯/氟苯嘧啶醇对雄激素受体(Androgen Receptor, AR)均具有拮抗作用。叶菌唑的两个对映体ds-RS和cis-SR经人CYP3A4酶代谢后,代谢产物对人AR受体拮抗效应差别显著,cis-SR呈现代谢活化,而cis-RS表现为代谢减毒。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：X592
【部分图文】：

生物活化和毒性降解等起着至关重要的作用。至今，人体内已发现的Ｐ４５０酶约有逡逑５０邋种，主要包括邋ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４邋等。逡逑其中ＣＹＰ３Ａ４酶占人肝脏和小肠中的Ｐ４５０酶的３０％左右（图１．３），是机体最重要逡逑Ｐ４５０酶。ＣＹＰ３Ａ４酶不仅能对内源性底物，如类固醇．脂肪酸等进行生物转化，逡逑也是许多外源性化学物质和药物的结合受体，重要的药物代谢酶，临床上约有５０％逡逑的药物靠它代谢。逡逑ＣＹＰ邋３Ａ４逡逑３４，４％逡逑巧逡逑图１．３人体肝内Ｐ４５０酶的组成逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．３邋Ｔｈｅ邋ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｐ４５０邋ｅｎｚｙｍｅ邋ｉｎ邋ｈｕｍａｎ邋ｌｉｖｅｒ逡逑１．３．２邋ＣＹＰ３Ａ４酶与污染物的相互作用逡逑目前关于Ｐ４５０酶与污染物的相互作用研究曰益增多。陈景文等通过密度泛函逡逑理论研究了关于ＣＹＰ４５０酶对ＢＤＥ－４７代谢的毒性机理和怲径，建立计算方法ＬNB预逡逑测参与污染物代谢转化的主要ＣＹＰ酶１Ｗ。吕酷等选取鼠ＣＹＰ２Ｂ１对；种手性ＰＣＢ逡逑进行了对映体水平上的代谢研究，发现Ｓ－ＰＣＢ邋４５和＜Ｓ－ＰＣＢ邋％可Ｗ被优先降解，逡逑代谢呈现立体差异，而ＰＣＢ邋１３２代谢则不存在对映体差异ＩＷ］。许多Ｓ唾类抗真菌逡逑药如l#康唾、伊曲康唾等是ＣＹＰ３Ａ４的强抑制剂，通过与酶分子直接结合Ｌ义抑制逡逑ＣＹＰ３Ａ４的酶活性

Ｆｉｇｕｒｅ邋１．４邋Ｔｈｅ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋Ｐ４５０邋Ｇｌｏ？邋Ａｓｓａｙ逡逑光谱逡逑学是利用生物大分子本身自带的巧光发色团（巧源巧光探的巧光发色团（外源巧光探针），结合各种相关的巧光分析、功能及交互作用等信息，广泛应用于小分子化合物与蛋白用研究。如Ｗｉｌｌｉａｍ等人曾经采用巧光分析技术对疏水性酶的结合位点、结合常数等进行探究ｉｎｉ。污染物通过氯键、华力等非共价结合力与蛋白结合后可能引起巧光光谱的变和偏振度的改变、特征吸收峰的位移、新巧光峰的出现等，巧光生色基团所处微环境的变化情况，并获得小分子化合物的相关参数和信息。逡逑

检测剂逡逑？逡逑图１．４Ｐ４５０Ｇ１Ｏ？检测原理图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．４邋Ｔｈｅ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋Ｐ４５０邋Ｇｌｏ？邋Ａｓｓａｙ逡逑１．４．３巧光光谱逡逑巧光光谱学是利用生物大分子本身自带的巧光发色团（巧源巧光探针）或通逡逑过外来标记的巧光发色团（外源巧光探针），结合各种相关的巧光分析技术来收逡逑集分子结构、功能及交互作用等信息，广泛应用于小分子化合物与蛋白质等生物逡逑大分子相互作用研究。如Ｗｉｌｌｉａｍ等人曾经采用巧光分析技术对疏水性探针ＴＮＳ逡逑和ＣＹＰ３Ａ４酶的结合位点、结合常数等进行探究ｉｎｉ。污染物通过氯键、疏水、静逡逑电作用或范德华力等非共价结合力与蛋白结合后可能引起巧光光谱的变化，如巧逡逑光福射强度和偏振度的改变、特征吸收峰的位移、新巧光峰的出现等，从而了解逡逑蛋白分子中巧光生色基团所处微环境的变化情况，并获得小分子化合物与生物大逡逑分子结合机制的相关参数和信息。逡逑１．５课题研究目的、巧容与意义逡逑１．５．１课题研究目的逡逑通过体外代谢实验并结合巧光光谱、分子模拟等方法分析ＣＹＰ３Ａ４酶介导的逡逑叶菌吨和氯／l#《喃巧醇代谢的对映体选择性差异，同时考察配体与人ＣＹＰ３Ａ４酶逦—逡逑的结合模式，了解配体的结合对人ＣＹＰ３Ａ４酶构象的具体影响，进一步从ＣＹＰ３Ａ４逡逑１１逡

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本文编号：2812331