芒草内生、根际土壤细菌群落分析及其促生特性测定

发布时间：2020-09-28 15:33

　　微生物与植物之间有着紧密的联系,在生态环境中也发挥着极其重要的作用,不仅担任着分解者的角色,同时还具有物质交换、能量转运、氨基酸合成等重要功能,在植物生长中把土壤的营养成分转化为可利用形态,转运到植物体的各个部位,从而对植物的生长起促进作用。植物与微生物在一个长期的共生过程中相互竞技、相互影响,在这个过程中植物也对其内生菌和根际土壤微生物的群落组成和结构产生影响,同时后者也能对植物的生长过程起到促进作用。本研究采用传统平板培养分离法将能源植物芒草(湘芒1号)内生、根际土壤细菌从4种不同培养基中分离鉴定并对其群落组成进行分析,同时对其分离鉴定到的菌种从产吲哚乙酸能力、氨基酸脱羧酶能力、溶磷能力等方面进行促生特性鉴定,以期确定芒草内生、根际土壤细菌的群落组成及其潜在功能;初步阐明细菌在芒草不同部位分布差异、规律及其潜在功能;丰富芒草内生、根际细菌菌种资源。主要试验结果如下:(1)运用传统平板分离的方法分别从芒草根、茎、叶和根际土壤中通过4种不同培养基(YN、TSA、LB、R2A)进行培养分离,共分离获得201株菌,通过16s rRNA基因序列分析对这些细菌进行鉴定,NCBI BLAST和EZ biocloud网站进行同源性比对结果显示:分离菌株包含了4门7纲10目20科31属68种,其中Proteobacteria门为优势菌门(占比45.58%),该门包括3纲5目9科15属菌,数量最大(占比36.35%),种类最多(占比38.23%)。Bacillus、Microbacterium、Sphingomonas为优势菌属,Bacillus属菌株数量最多总占比达28.35%,在Actinobacteria门占比94.52%。(2)对其中的68个种的细菌进行植物促生能力测定,实验结果显示:芒草内生、根际土壤细菌均可产生吲哚乙酸,平均值13.06 mg/L,但芒草根部分离的菌株Klebsiella michiganensis(编号TG19)和芒草茎部分离的菌株Providencia rettgeri(编号LJ7)吲哚乙酸产量最高,分别达到了61.2和58.6 mg/L,Klebsiella michiganensis不仅产吲哚乙酸能力较强,而且氨基酸脱羧酶和溶磷能力上也表现较强能力,溶磷量达到了177.3 mg/L;但在氨基酸脱羧酶能力上差异较大,其中芒草根部分离菌株在3种氨基酸脱羧酶能力上整体能力较强;供试菌株溶磷能力差异性不显著,69%的供试菌株溶磷量都在100 mg/L和200 mg/L之间。(3)在芒草茎部分离了两株疑似新种RS10和RS1,实验对这两株菌从遗传学特征、表型及生理生化特征、化学特征等方面作进一步鉴定。结果显示,菌株RS10是Pedobacter的一个新种,RS1是Mucilaginibacter的一株新种:(1)经EZ biocloud网站比对,RS10 16S rRNA序列与Pedobacter kyungheensis KACC16221(T)(97.78%)相似度最近,该菌株DNA G+C含量为39.7 mol%;菌落形态为浅黄色、圆形、凸形菌,细胞呈杆状,有氧,无运动,无孢子形成,宽约0.1~0.13μm,长约0.30~0.45μm;主要细胞脂肪酸为iso-C_(15:0)、iso-C_(17:0)-3OH和Summed Feature 3(C_(16:1) w7c和C_(16:1)6:1 w6c);主要类异戊二烯醌为MK-7;主要极性脂为磷脂酰乙醇胺和氨基磷脂,该菌株命名为Pedobacter nanyangensis sp.nov.。(2)经EZbiocloud网站比对,RS1 16S rRNA序列与M.kameinonensis NBRC 102645T(98.70%)相似度最近,该菌株DNA G+C含量为42.80 mol%;菌落形态光滑、浅粉红色、凸起。细胞呈杆状,有氧,无运动,无孢子形成,宽约0.15~0.20μm,长约0.40~0.80μm;主要细胞脂肪酸为iso-C_(15:0),iso-C_(16:0),iso-C_(17:0)-3OH,summed feature 3(C_(16:1)6:1 w7c和iso-C_(15:0)-2OH);主要的类异戊二烯醌是MK-7;主要极性脂是磷脂酰乙醇胺、氨基磷脂、磷脂和两种未知的脂质,该菌株命名为Mucilaginibacter nanyangensis sp.nov.。
【学位单位】：南阳师范学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S578;S154.3
【部分图文】：

技术路线图,技术路线,细菌群落,芒草

技术路线

栽培示范,概况,基地,无机盐

图 2-1 能源植物栽培示范基地概况Fig 2-1 General situation of energy plant cultivation demonstration base2.1.3 培养基的选择本实验设计选用 4 种培养基培养芒草内生和根际土壤细菌，分别选用了以蔗糖供碳源、酵母膏提供有机氮源、各种微量元素提供无机盐的 YN 培养基和以酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖提供碳源、有机氮源，各种微量元素提供无机盐的 R2A 培养基同时还选取了以蛋白胨、酵母膏提供碳、氮源，Na 离子提供所需无机盐的 LB 培基和以蛋白胨、葡萄糖提供碳、氮源，Na、K 离子提供无机盐的 TSA 培养基[44]。表 2-1 培养基配方Table 2-1 Medium distribution培养基类型培养基配方YN蔗糖 10.0 g/L;(NH4)2SO41.0 g/L;k2HPO42.0 g/L;MgSO40.5 g/L;NaCl 0.1 g/L;酵母膏 0.5 g/L;CaCO30.5 g/L;琼脂粉 20 g/L;蒸馏水;pH 7.2

土壤样品,步骤

和研磨棒都不能重复使用防止污染）中，加入石英砂研磨至粉分离出微生物），将粉碎的植物样品收集入灭过菌的 50 mL 离菌水，在涡旋振荡器上进行 3 s 混匀处理，此时溶解后的液体壤样品处理：取回后的土壤样品先进行去杂处理，挑出样品中片、昆虫以及其他杂物，然后称取 10 g 纯净的根际土壤加入到形瓶中，放入摇床速度 200 r/min 混匀处理 10 min，取混匀后准备好的无菌的装有9 mL无菌水的25 mL试管中，此时样品即 10-1，同样取在 10-1取 1 mL样品（取样前需在涡旋振荡器上混菌的装有 9 mL 无菌水的 25 mL 试管中，此时样品即为梯度 2照同样的方式（图 2-2）稀释到梯度 5，梯度为 3、4、5 样品9]。

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