Acinetobacter pittii L1的分离鉴定与吲哚降解机理的研究

发布时间：2020-09-30 00:20

　　含氮杂环化合物(Nitrogen Heterocyclic Compounds,NHCs)是含有N原子的一类杂环化合物,含氮杂环化合物广泛存在于自然界中,其中包括医用废水、农药废水、焦化废水、石油冶炼和染料废水等工业废水中。NHCs是污染涉及范围广、环境效应大的难降解有机物,对环境以及人类具有较大的威胁。常见的含氮杂环化合物有吲哚、吡啶、喹啉、异喹啉、吡咯、咪唑及其衍生物等,使用合适的方法去除这类化合物成为人们亟待解决的问题。本文以吲哚为主要研究对象,于实验室中在好氧条件下筛选出一株对吲哚有降解作用的菌株。通过微生物学、分子生物学等方法探讨了该菌株降解吲哚的降解性能、生物毒性的变化、代谢产物的途径以及吲哚降解酶的纯化。主要结果有:1.本研究从焦化厂废水处理系统中的污泥水样中,在好氧条件下分离、驯化出一株能有效降解吲哚的菌株L1。基于生理生化实验以及16S rRNA基因序列同源性分析,该菌株被鉴定为不动杆菌属(Acinetobacter pittii),最终命名该菌为Acinetobacter pittii L1不动杆菌。2.本研究探讨了菌株L1生物降解吲哚的降解性能。试验结果表明,菌株在37°C,pH为7.0以及摇床转速为150 r/min的条件下,降解效果最好。低浓度(100 mg/L)的吲哚在18 h被完全降解,而400 mg/L的吲哚则需要2 d才能被完全降解。不仅如此,菌株L1对于低浓度的喹啉也表现出较为良好的降解效果,而苯酚和吡啶的降解效果不理想。3.本研究探讨了体系反应时TOC的去除及毒性的变化情况。结果表明,当吲哚被完全降解时,TOC和TC未完全去除,推测其大部分的有机碳转化为CO_2扩散至大气中,还有小部分则转化为CO32-与溶液中的离子结合转变成盐,也可能吲哚被分解后产生小分子的挥发性产物转移至大气中。同时,生物毒性实验结果表明,吲哚降解过程中大部分的吲哚被缓慢地矿化,部分转化成CO_2和H2O,以气体形式扩散到环境中,该现象说明吲哚并没有被完全代谢成中间产物。此外,实验显示中间代谢产物毒性有所增加,随着降解时间的推进,体系最终的毒性较之初始毒性略有降低。4.通过HPLC-MS/MS的二级质谱图的分析,初步推测出吲哚的生物降解产物分别为靛蓝、靛红以及4-(3羟基-吡咯)-2氧基丁烯酸,这些产物中靛蓝是因为羟吲哚的二聚作用产生。靛红则是吲哚被氧化成吲哚酮后,继续被氧化而生成。4-(3羟基-吡咯)-2氧基丁烯酸则是吲哚降解过程中形成双羟基吲哚后,苯环被在C4号位被还原,开环后生成。本实验根据生物降解的这几个中间代谢产物,推测出了吲哚的三条代谢途径。5.本实验还研究了纯化后吲哚降解酶的特性,定位实验结果显示,降解酶主要为胞内蛋白成分。使用DE-52方法对降解酶进行纯化,纯化后的酶蛋白的比活力为粗酶液的9倍左右,纯化效果较为理想。除此之外酶促反应的最佳温度为35°C,最适pH为6.0-7.0。不同金属离子对该酶产生较大的影响,所以猜测该酶为金属酶。其中,1.0 mM的Ca~(2+)和Mg~(2+)对于酶促反应促进作用,相同浓度的Zn~(2+)则对酶促反应表现为较强的抑制作用。
【学位单位】：广东工业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：X172;X592
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章绪论
    1.1 含氮杂环化物
    1.2 氮杂环化合物的来源和用途及理化和毒性特征
        1.2.1 含氮杂环化合物的来源和用途
        1.2.2 氮杂环化合物的理化和毒性特征
    1.3 含氮杂环化合物废水的处理现状
        1.3.1 物理化学法处理含氮杂环化合物废水的研究现状
        1.3.2 生物法处理含氮杂环化合物废水的研究现状
    1.4 吲哚的生物降解
        1.4.1 细菌与真菌对吲哚的降解
        1.4.2 吲哚降解的酶系
        1.4.3 吲哚降解的代谢产物
    1.5 本课题的研究意义
第二章吲哚降解菌的筛选及鉴定
    2.1 材料
        2.1.1 吲哚
        2.1.2 样品来源
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 培养基
        2.1.5 主要的仪器及型号
    2.2 实验方法
        2.2.1 降解菌的筛选
        2.2.2 降解菌的鉴定
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 吲哚降解菌的筛选结果
        2.3.2 降解菌形态和生理生化特性
        2.3.3 菌种的初步鉴定结果
    2.4 本章小结
第三章吲哚的降解动力学、毒性变化和产物机制研究
    3.1 实验材料
        3.1.1 菌种来源
        3.1.2 主要试剂与实验仪器
        3.1.3 培养基
        3.1.4 菌悬液的制备
    3.2 实验方法
        3.2.1 菌株L1降解吲哚过程中TOC变化的测定方法
        3.2.2 高效液相色谱法测定污染物浓度方法
        3.2.3 生物降解吲哚的特性研究方法
        3.2.4 生物降解吲哚的毒性测定方法
        3.2.5 生物降解吲哚的产物测定方法
    3.3 实验结果与讨论
        3.3.1 外界环境对菌株L1生物降解NHC的影响因素
        3.3.2 生物降解吲哚过程中的TOC和毒性变化情况
        3.3.3 生物降解吲哚的主产物及其降解路径
    3.4 本章小结
第四章吲哚降解酶的特性
    4.1 实验材料
        4.1.1 菌种来源
        4.1.2 主要试剂以及实验仪器
        4.1.3 培养基
    4.2 实验方法
        4.2.1 降解酶的的制备和定位以及酶活的测量
        4.2.2 吲哚降解酶的分离纯化
        4.2.3 蛋白质含量的测定
        4.2.4 降解酶的活性与稳定性
            4.2.4.1 环境温度影响下降解酶的活性与稳定性
            4.2.4.2 环境pH影响下降解酶的活性与稳定性
            4.2.4.3 金属离子影响酶的活性与稳定性
    4.3 实验结果与分析
        4.3.1 菌株L1吲哚降解酶的的定位
        4.3.2 菌株L1吲哚降解酶分离纯化
        4.3.3 降解酶的活性与稳定性
            4.3.3.1 环境温度影响下降解酶的活性与稳定性
            4.3.3.2 环境pH影响下降解酶的活性与稳定性
            4.3.3.3 金属离子影响下酶的活性与稳定性
    4.4 本章小结
第五章总结
参考文献
攻读学位期间发表的论文
致谢

【参考文献】