辛硫磷与Cry1Ca对甜菜夜蛾的协同作用及增效机理研究

发布时间：2020-10-15 00:57

　　 甜菜夜蛾Spodoptera exigua Hübner是一种间歇性暴发的多食性害虫,自20世纪80年代中后期以来,在棉田的危害越来越严重,主要依靠化学农药对其进行防治。辛硫磷(phoxim)是一种高效、广谱的有机磷杀虫剂,广泛用于防治咀嚼式口器害虫;Cry1Ca是一种对甜菜夜蛾具有高毒力的微生物源杀虫蛋白,但使用单一药剂易导致甜菜夜蛾产生抗药性。农药复配具有扩大防治谱、协同增效及延缓害虫抗药性等优点。因此,本试验旨在通过研究辛硫磷(LC_(30))与Cry1Ca(LC_(30))复配(简称混剂)对甜菜夜蛾的毒力变化,明确混剂对甜菜夜蛾毒力的协同作用,探索混剂协同增效对甜菜夜蛾解毒酶、抗性相关基因及体内共生微生物的影响,为揭示和阐明辛硫磷与Cry1Ca的增效机理及甜菜夜蛾产生抗性的分子机理提供理论依据。主要研究结果如下所示:1、利用表面污染法研究了辛硫磷与Cry1Ca的亚致死剂量对甜菜夜蛾的毒力作用。与空白处理相比,取食混剂的甜菜夜蛾2龄幼虫在3 d、5 d、7 d的死亡率分别为52.73%、93.13%、95.87%,分别比单独取食辛硫磷和Cry1Ca试虫的死亡率提高了22.06%、48.46%、50.87%和52.73%、75.40%、78.14%,故混剂毒力显著高于两个单剂;取食混剂的幼虫历期延长至15.6 d,分别比取食辛硫磷和Cry1Ca的幼虫历期延长了2.1 d和4.7 d。因此,混剂对防治甜菜夜蛾的协同增效作用显著。2、混剂对甜菜夜蛾碱性磷酸酯酶表达水平具有较大的影响。试验通过RACE技术获得甜菜夜蛾可溶性碱性磷酸酯酶基因SesALP1、SesALP2的全长序列,且发现SesALP1、SesALP2均在幼虫中肠组织呈现高表达水平;利用qPCR分析混剂对Se ALP mRNA表达水平的影响,结果表明SesALP1和SesALP2的表达水平在处理32 h后分别表现为上调和下调;在处理0 h~32 h,SemALP1的表达水平随取食时间推移呈先升高后降低的趋势,SemALP2~SemALP5的表达水平呈先下降后上升的趋势。3、混剂对甜菜夜蛾解毒酶及抗性相关基因具有较大的影响。甜菜夜蛾取食辛硫磷、Cry1Ca及混剂8 h后,试虫CAT活力显著升高,分别是空白处理的37.74倍、1.23倍、43.65倍,混剂处理组CAT活力显著高于单剂处理;在处理24 h后,药剂处理试虫体内AChE活性均显著低于空白处理,但各处理间差异不显著;在处理8 h和24 h后,Cry1Ca处理组CarE活力分别是空白处理的4.97和1.42倍,辛硫磷和混剂对CarE活力的抑制率分别为37.72%、65.35%和45.27%、52.36%,故Cry1Ca对CarE活性具有诱导作用,辛硫磷、混剂对CarE活性均具有抑制作用。通过qPCR进一步对试虫抗性相关基因P450和ABCC在0 h~24 h表达水平的变化进行分析,结果表明ABCC3、ABCC4、ABCC12的表达水平先降低后升高,而CYP4L7、CYP4M15、CYP4S9、CYP6AB31、CYP6AE47、CYP6AE97、CYP9A9、CYP9A10、ABCC1、ABCC2、ABCC5、ABCC6表达水平先上升后降低。4、混剂对甜菜夜蛾体内共生微生物的多样性具有较大影响。运用16S rDNA宏基因组测序技术,检测辛硫磷与Cry1Ca的协同增效对甜菜夜蛾体内共微生物多样性的影响。经统计分析得到用于物种分类的OTUs数目为4318,RS1(辛硫磷+Cry1Ca)、RS2(辛硫磷)、RS3(Cry1Ca)、RS4(空白对照)4组处理样品的稀释曲线均逐渐趋于平缓,可基本反映处理试虫体内微生物的群落组成。OTUs聚类结果显示,4组样品微生物群落丰度的大小为RS2RS3RS1RS4;由Beta多样性指数组间差异分析可知,4组样品微生物群落的多样性顺序为RS2RS3RS4RS1,故混剂显著降低了试虫体内微生物的多样性;4种处理在门水平上和纲水平上的绝对优势菌群分别有4种(厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门)和6种(梭菌纲、芽孢菌纲、α变形菌纲、γ变形菌纲、放线菌纲、拟杆菌纲)。从属水平分析可知,辛硫磷与Cry1Ca复配显著提高了红球菌属的丰度、显著降低了乳酸菌属和不动菌属的丰度。综上所述,辛硫磷与Cry1Ca二者混用对甜菜夜蛾的毒力具有明显的增效作用,并且药剂的协同作用对甜菜夜蛾体内部分保护酶活力、解毒酶活力、抗性基因表达水平以及体内微生物群落结构产生影响,导致其对药剂的敏感性发生改变。本项研究初步明确了辛硫磷与Cry1Ca对甜菜夜蛾的协同作用及增效机理,为甜菜夜蛾的抗药性治理和科学防治提供理论指导。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S433.4
【部分图文】：

中国农业科学院硕士学位论文 第二章 辛硫磷与 Cry1Ca 的混剂对甜菜夜蛾的协同增效作用2.4 结果与分析2.4.1 辛硫磷、Cry1Ca 对甜菜夜蛾 2 龄幼虫的毒力由图 2-1 可知，在辛硫磷单剂（A）的作用下，当浓度为 368.42 ng/cm2时，甜菜夜蛾幼虫的死亡率与对照处理相比未达到显著差异；当处理浓度≥1247.37 ng/cm2时，各药剂处理间试虫死亡率无显著差异。在 Cry1Ca 单剂（B）作用下，当浓度为 0.99 ng/cm2时，幼虫死亡率与对照处理无显著差异；当处理浓度≥157.89 ng/cm2时，各药剂处理间幼虫死亡率无显著差异。

表 2-4 甜菜夜蛾 2 龄幼虫取食 Cry1Ca 7 d 后的体重抑制率Table 2-4 Inhibition rate of S. exigua larvae weight after treated 7 d with Cry1Ca剂量(ng/cm2)Concentration0 9.87 19.74 39.47 78.95 157.89 315.78体重抑制率（%）Inhibition rate ofweight0.00 ±0.00 d57.13 ±0.07 c78.24 ±1.42 b81.34 ±1.53 b94.26 ±0.47 a94.76 ±0.95 a96.59 ±0.45 a注：数据后标有不同小写字母表示数据间在 0.05 水平上差异显著（P﹤0.05）。下表同。Note: Data in the same row followed by different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level.2.4.2 混剂对甜菜夜蛾 2 龄幼虫的毒力取食亚致死剂量辛硫磷与 Cry1Ca 的混剂的甜菜夜蛾 2 龄幼虫，在药后 3、5、7 d 试虫的际死亡率分别为 52.73%、93.13%和 95.87%，远高于混剂处理药后 3 d（30.67%）、5 d（54.40%和 7 d（54.69%）的甜菜夜蛾期望死亡率（图 2-2A）。比较甜菜夜蛾取食亚致死剂量混合药剂后 3、5、7 d 的实际死亡率和期望死亡率，所得卡方值分别为 15.87、27.57 和 33.03，均大于 3.8故辛硫磷与 Cry1Ca 具有协同增效作用。试验同时发现，亚致死剂量的混合药剂显著抑制存活菜夜蛾幼虫体重增长（图 2-2B），药后 3 d 混合物对甜菜夜蛾幼虫的抑制效果显著高于 Cry1Ca 辛硫磷单剂；药后 5 d 混合药剂对存活幼虫的抑制作用显著高于 Cry1Ca，但与辛硫磷无显著差异

21图 3-2 甜菜夜蛾 SesALP1、SesALP2 氨基酸序列的多重序列比对结果右侧的数字表示蛋白质序列上氨基酸的位置，信号肽位置用实线标出，碱性磷酸酶激活序列用实线方框标出，碱性磷酸酶激活位点用下方小黑三角表示，底物结合位点用上方小实心圆点表示。Fig.3-2 Protein sequence alignment of SesALP1, SesALP2 from S. exigua larvae.Numbers on the right side of the alignment indicate the position of residues in the protien.The predicted N-terminal signalpeptide sequence are lined.The predicted phosphatase domains are marked in box. The predicted phosphatase active sitesare indicated by black triangle.Substrate binding sites are marked by dot above.
【参考文献】

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本文编号：2841451