具杀植物线虫活性的芽孢杆菌筛选
发布时间：2020-10-24 03:33
植物寄生性线虫是引起植物病害的主要病原物之一,其寄主范围广、为害严重,每年对农业生产造成的经济损失达1500多亿美元。目前防治植物寄生线虫仍然以化学防治为主,但其毒性较大、污染环境,对人畜健康存在潜在威胁。随着高毒农药在我国的禁用,亟需开发绿色环保、安全的生防菌来防治植物寄生线虫。本研究采集湖南省不同类型土壤,并对土壤中的细菌进行了分离、筛选,获得了一株对马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)和水稻拟禾本科根结线虫(Meloidogyne graminicola)都具有显著抑制活性的菌株D45。利用形态学、生理生化和分子生物学技术对其进行鉴定,并对其进行发酵条件优化和对发酵产生的杀线虫物质进行了初步分析。主要研究和结果如下:1、采用土壤稀释法,从湖南省张家界、大围山等土壤较为肥沃、微生物较为丰富且无人工污染的地区采集不同类型的土壤样品中分离得到186株细菌。初筛以马铃薯腐烂茎线虫为靶标线虫,采用直接触杀法对土壤分离细菌进行筛选,初筛获得8株具有较高杀线虫活性的菌株。以拟禾本科根结线虫二龄幼虫为靶标线虫进行复筛,发现D45、D54菌株对拟禾本科根结线虫二龄幼虫的活性较高。其中D45菌株发酵液的杀虫活性最高,其发酵液上清5倍稀释液处理24 h、48 h后,马铃薯腐烂茎线虫和拟禾本科根结线虫二龄幼虫的死亡率分别为69.8%、72.1%和60.9%、70.4%。2、盆栽试验结果表明,菌株D45发酵液稀释2倍、5倍后对水稻拟禾本科根结线虫的防治效果分别为79.1%和64.8%。菌株D54发酵液对水稻拟禾本科根结线虫的防治效果相对D45较差,其2倍和5倍稀释液的防治效果分别为66%和45.7%%。田间试验结果表明,菌株D45发酵液稀释2倍、5倍后对水稻拟禾本科根结线虫的防治效果分别为56.3%和53.0%;菌株D54发酵液稀释2倍、5倍后对水稻拟禾本科根结线虫的防治效果分别为52.0%和44.3%。3、通过显微形态观察,生理生化测定结合16SrDNA序列系统发育分析,鉴定菌株D45为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、D54为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)。4、采用单因素法对活性菌株D45发酵条件进行了优化,确定其最佳氮碳源的配方为:麦芽糖30g/L、蛋白胨4g/L;最佳发酵条件为:温度30℃、转速180r/min、pH值7.5。5、代谢产物毒力测试结果表明,菌株D45发酵液对秀丽隐杆线虫具有较高的杀虫活性,并可抑制其运动和扩散行为;菌株D45发酵液挥发物对马铃薯腐烂茎线虫有一定的杀线活性。推测D45菌株代谢活性物质中可能存在作用于线虫运动神经的挥发性小分子化合物。
【学位单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S476.1
【部分图文】：
1492r(5'－GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行 16SrDNA 的 PCR 扩增。PCR 件:95℃预变性 2.5min，94℃变性 30S，55℃复变性 1min，72℃延伸 1min，35 个72℃延伸 10min。扩增产物纯化后连接到 pMD18-T(TaKaRa)克隆载体中，筛选隆送上海生工生物工程有限公司测序。将菌株的 16S rDNA 的测序序列与 GenBank 中已登录的序列进行 BLAST 选取序列相似性较高的典型菌株的基因序列作为参比对象，应用 Mega5.0 的 NeJoining (NJ)方法构建系统发育树（稳定性检测重复取样 1000 次），进行聚类分4.3 结果与分析4.3.1 芽孢杆菌 D45 的鉴定4.3.1.1 高活性菌株 D45 的形态观察鉴定在牛肉膏蛋白胨培养基上 25℃±1℃培养 24h 的菌落形态不规则，边缘褶皱糙不透明，表面干燥，呈乳白色或米黄色（图 4-1）。在光学显微镜下观察，D株菌体呈杆状、端圆（图 4-2），鞭毛周身。
1492r(5'－GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行 16SrDNA 的 PCR 扩增。PCR 件:95℃预变性 2.5min，94℃变性 30S，55℃复变性 1min，72℃延伸 1min，35 个72℃延伸 10min。扩增产物纯化后连接到 pMD18-T(TaKaRa)克隆载体中，筛选隆送上海生工生物工程有限公司测序。将菌株的 16S rDNA 的测序序列与 GenBank 中已登录的序列进行 BLAST 选取序列相似性较高的典型菌株的基因序列作为参比对象，应用 Mega5.0 的 NeJoining (NJ)方法构建系统发育树（稳定性检测重复取样 1000 次），进行聚类分4.3 结果与分析4.3.1 芽孢杆菌 D45 的鉴定4.3.1.1 高活性菌株 D45 的形态观察鉴定在牛肉膏蛋白胨培养基上 25℃±1℃培养 24h 的菌落形态不规则，边缘褶皱糙不透明，表面干燥，呈乳白色或米黄色（图 4-1）。在光学显微镜下观察，D株菌体呈杆状、端圆（图 4-2），鞭毛周身。
生防细菌 D45 的生理生化特性表现为革兰氏反应为阳性，可水解淀粉，能与硝酸盐产生还原反应，甲基红试验为阴性反应，能利用过氧化氢酶，不产硫化氢，具备分解明胶的能力，乙酰甲基甲醇试验为阳性。其特征符合《常见细菌系统鉴定手册》[58]中关于芽孢杆菌的描述（表 4-1）。表 4-1 菌株 D45 的部分生理生化特性Table 4-1 Physiological and biochemical characteristics of strain D45测试项目Items tested特性CharacteristicH2S 试验 -甲基红试验 Methyl-red +明胶液化 Gelatin liquefaction +硝酸盐还原 Nitrate reduction +淀粉水解 Starch hydrolysis +糖氧化发酵测定 Sugar fermentation -接触酶 Catalase +乙酰甲基甲醇 Acetyl methyl carbinol +革兰氏染色 Gram staining G+
【参考文献】
本文编号：2853960
【学位单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S476.1
【部分图文】：
1492r(5'－GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行 16SrDNA 的 PCR 扩增。PCR 件:95℃预变性 2.5min，94℃变性 30S，55℃复变性 1min，72℃延伸 1min，35 个72℃延伸 10min。扩增产物纯化后连接到 pMD18-T(TaKaRa)克隆载体中，筛选隆送上海生工生物工程有限公司测序。将菌株的 16S rDNA 的测序序列与 GenBank 中已登录的序列进行 BLAST 选取序列相似性较高的典型菌株的基因序列作为参比对象，应用 Mega5.0 的 NeJoining (NJ)方法构建系统发育树（稳定性检测重复取样 1000 次），进行聚类分4.3 结果与分析4.3.1 芽孢杆菌 D45 的鉴定4.3.1.1 高活性菌株 D45 的形态观察鉴定在牛肉膏蛋白胨培养基上 25℃±1℃培养 24h 的菌落形态不规则，边缘褶皱糙不透明，表面干燥，呈乳白色或米黄色（图 4-1）。在光学显微镜下观察，D株菌体呈杆状、端圆（图 4-2），鞭毛周身。
1492r(5'－GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行 16SrDNA 的 PCR 扩增。PCR 件:95℃预变性 2.5min，94℃变性 30S，55℃复变性 1min，72℃延伸 1min，35 个72℃延伸 10min。扩增产物纯化后连接到 pMD18-T(TaKaRa)克隆载体中，筛选隆送上海生工生物工程有限公司测序。将菌株的 16S rDNA 的测序序列与 GenBank 中已登录的序列进行 BLAST 选取序列相似性较高的典型菌株的基因序列作为参比对象，应用 Mega5.0 的 NeJoining (NJ)方法构建系统发育树（稳定性检测重复取样 1000 次），进行聚类分4.3 结果与分析4.3.1 芽孢杆菌 D45 的鉴定4.3.1.1 高活性菌株 D45 的形态观察鉴定在牛肉膏蛋白胨培养基上 25℃±1℃培养 24h 的菌落形态不规则，边缘褶皱糙不透明，表面干燥，呈乳白色或米黄色（图 4-1）。在光学显微镜下观察，D株菌体呈杆状、端圆（图 4-2），鞭毛周身。
生防细菌 D45 的生理生化特性表现为革兰氏反应为阳性，可水解淀粉，能与硝酸盐产生还原反应，甲基红试验为阴性反应，能利用过氧化氢酶，不产硫化氢，具备分解明胶的能力，乙酰甲基甲醇试验为阳性。其特征符合《常见细菌系统鉴定手册》[58]中关于芽孢杆菌的描述（表 4-1）。表 4-1 菌株 D45 的部分生理生化特性Table 4-1 Physiological and biochemical characteristics of strain D45测试项目Items tested特性CharacteristicH2S 试验 -甲基红试验 Methyl-red +明胶液化 Gelatin liquefaction +硝酸盐还原 Nitrate reduction +淀粉水解 Starch hydrolysis +糖氧化发酵测定 Sugar fermentation -接触酶 Catalase +乙酰甲基甲醇 Acetyl methyl carbinol +革兰氏染色 Gram staining G+
【参考文献】
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本文编号：2853960
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