ε-聚赖氨酸抑制植物病毒及病原真菌的作用及机制研究

发布时间：2020-10-30 23:07

　　 ε-聚赖氨酸(ε-PL)是由微生物代谢产生的一种水溶性、可生物降解且具广谱抗微生物活性的多肽类物质,其主要用于食品防腐剂上,但对植物病毒和植物病原真菌的抑制作用和机制尚未见报道,本文利用从细黄链霉菌辽宁致病变种中分离纯化获得的具有自主知识产权的ε-PL(发明专利受理号:201910330737.2)进行温室盆栽、荧光检测、Northern blot分析和透射电子显微镜观察等试验,研究了ε-PL对烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)的抑制作用及机制;又通过平板抑菌试验、离体叶接种试验、孢子萌发抑制试验和实时荧光定量PCR(qPCR)试验,研究了ε-PL对植物真菌病害的防治作用及机理;通过对ε-PL处理后烟草BY-2细胞的RNA-Seq测序分析,研究了ε-PL对烟草植株抗病相关基因的诱导表达作用。以上研究为深入了解ε-PL对植物病毒和植物病原真菌的抑制作用及其机制提供了重要理论基础。主要研究成果如下:1.ε-PL对TMV有明显钝化作用和预防效果。ε-PL在2000μg/ml浓度处理枯斑寄主心叶烟时,对TMV的钝化抑制率和预防效果分别达到90.6%和79.3%,同浓度ε-PL处理系统侵染寄主普通烟NC89,对TMV的钝化和预防效果分别为72.35%和56.7%;荧光检测接种了转绿色荧光蛋白(GFP)TMV的本氏烟苗,结果显示无论是接种叶、上位叶还是顶叶的荧光斑点,药剂处理组都较对照组明显减少,其中100μg/mlε-PL处理的本氏烟的顶叶基本未见荧光斑点,而对照组顶叶绿色荧光区域明显;Northern blot检测分析了不同浓度ε-PL处理下接种TMV的烟叶和烟草BY-2原生质体,结果显示ε-PL处理下样品中TMV-RNA的量明显减少,表明ε-PL影响了病毒核酸的合成和积累量;透射电子显微镜观察结果表明,ε-PL可使病毒粒子发生断裂、破损等现象。2.ε-PL对植物病原真菌具有显著抑菌作用。用不同浓度的ε-PL对烟草赤星病菌、黄瓜褐斑病菌和水稻恶苗病菌进行平板抑菌试验,结果显示ε-PL对烟草赤星病菌和黄瓜褐斑病菌可以产生清晰明显的抑菌圈,且ε-PL对烟草赤星病菌的最小抑菌浓度(MIC值)为5μg/ml,对黄瓜褐斑病菌的MIC值为10μg/ml,但ε-PL对水稻恶苗病菌的抑菌效果不显著;离体叶接种试验表明,ε-PL对烟草、黄瓜离体叶有明显阻止病斑扩展的作用,且与对照相比,ε-PL对烟草赤星病斑扩展的阻止效果更为显著;ε-PL对病菌菌丝生长的抑制试验表明,200μg/mlε-PL处理3天时对烟草赤星病菌菌丝生长的抑制率达92%,处理7天的抑制率也高达87%左右,表明ε-PL稳定性好,抑制作用强,可以长时间控制菌丝生长;ε-PL对病菌孢子萌发和芽管形态影响显微观测表明,当25μg/ml的ε-PL处理24h后,烟草赤星病菌孢子萌发产生的芽管会出现皱缩、畸形等变化;当浓度达到200μg/ml时,对孢子萌发的抑制率接近98%;ε-PL对烟草赤星病菌菌丝萌发及生长相关基因如环腺苷酸依赖性蛋白激酶A基因(PKA)、Alternaria alternata环腺苷酸依赖性蛋白激酶催化亚基(AAPK1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)和5.8s核糖体rRNA代表基因进行qPCR检测,结果显示前三个基因在ε-PL处理后发生显著下调表达,从分子水平揭示了ε-PL对真菌抑制的作用机制。3.为了进一步了解ε-PL对寄主是否具有诱抗作用,利用ε-PL处理烟草BY-2细胞进行了转录组测序及功能分析。差异基因聚类分析结果表明,烟草热休克同源蛋白70 kDa基因和与衰老相关蛋白等1350个基因表达量与对照相比显著上调,而烟草花色素3-O-葡糖基转移酶基因和烟草叶片表皮特异性分泌型糖蛋白等1700多基因与对照相比表达量发生显著下调表达;差异基因Gene Ontology(GO)富集性分析显示,ε-PL处理后烟草细胞显著差异表达基因在生物学功能中主要富集于转录调控相关基因上,在细胞组分中主要富集于与细胞核、细胞质、质膜和膜的组成相关的基因上,在分子功能方面主要富集于与蛋白质结合相关、与转录相关或与有特殊序列的DNA结合功能相关的基因上,以上基因间接起到调控植物生长发育、进化和抗逆境等作用。差异基因Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集性分析显示,差异基因主要富集于与植物热反应相关,与毒素代谢相关,与氧化反应相关等重要通路上。综上推测,ε-PL对烟草具有诱导抗病性作用。
【学位单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S432.41;S432.44
【部分图文】：

图 2-1 不同浓度 ε-PL 对普通烟上 TMV 的抑制效果 2-1 Inhibition effect of different concentrations of ε-PL on TMV on N. tabacum L. cv.

图 2-2 500 μg/ml ε-PL 处理心叶烟上 TMV 的枯斑抑制效果Figure 2-2 Anti-TMV effect on N. glutinosa treated with 500 μg/ml ε-PL

图 2-3 不同浓度 ε-PL 处理下接种 TMV 心叶烟的枯斑状况Figure 2-3 Nocrotic lesions on N. glutinosa inoculated with TMV under differentconcentrations of ε-PL
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本文编号：2863124