碳代谢调节因子Cra调控骆驼刺泛菌在小麦根部定殖能力的分子机制研究

发布时间：2020-11-10 08:09

　　 干旱是影响全球作物生长和生产力的主要环境压力之一,而全球变暖和水资源短缺加速了环境恶化程度。因此,当前迫切需要增强农作物抗逆性,提高其抗旱能力。植物内生菌可以帮助植物应对来自外界的逆境胁迫,增强抗压能力,而植物与微生物互作的先决条件是内生菌能够有效地定殖在植物体内。本实验室在前期研究中发现了一株具有多种促植物生长功能的内生细菌骆驼刺泛菌Pantoea alhagi LTYR-11Z。该菌株可以有效定殖在小麦根部组织并提高宿主的抗旱能力。前期通过构建该菌株的转座子插入突变体文库,筛选到一个与定殖相关的全局调控基因cra。利用转录组数据分析(RNA-seq),发现cra敲除突变株中284个基因的转录水平与野生型相比具有显著差异,其中180个基因受到Cra蛋白的正向调控,104个受其负调控。通过对转录组数据深入挖掘,发现eps操纵子(B1H58_14485-B1H58_14530)在?cra中的表达量中显著下调。通过实时定量PCR(Real Time PCR)、β-半乳糖苷酶酶活检测以及凝胶阻滞迁移(EMSA),本研究确定了Cra直接正向调控eps操纵子的转录,进而预测并通过点突探针验证了Cra与eps操纵子启动子的结合位点。本研究还检测了野生型P.alhagi LTYR-11Z,?cra突变体与互补菌株中胞外多糖(EPS)的产量,证实了Cra对胞外多糖生物合成的正调控作用。随后采用结晶紫染色法检测了野生型,?cra,?tuaG突变株生物膜生成量,发现Cra通过促进eps操纵子的表达而促进其生物膜的生成。转录组数据中anti-FlhD_4C_2因子同源基因ydiV(B1H58_18220)在?cra中的表达下调超过2.2倍,表明Cra可能调控鞭毛的生物合成。本研究通过泳动实验发现突变cra基因后菌株运动能力增强,与单一敲除cra基因相比,敲除cra、ydiV基因后菌株运动能力进一步提升,并且在双突菌株中回补cra未能使运动能力恢复至野生型水平,说明Cra通过调节ydiV基因的表达抑制P.alhagi LTYR-11Z的运动能力。为证明YdiV作为anti-FlhD_4C_2因子的活性,采用EMSA检测了His6-YdiV对His6-FlhD_4C_2和fliA启动子之间相互作用的影响,结果表明在P.alhagi LTYR-11Z中ydiV编码抑制FlhD_4C_2与fliA启动子结合的anti-FlhD_4C_2因子;采用同样的方法确定了Cra直接正向调控ydiV基因的表达,并预测和验证了Cra与ydiV启动子的结合位点。在转录组数据中发现编码负责c-di-GMP合成的双鸟苷酸环化酶的yedQ的转录显著下调。本研究采用体外酶活实验检测P.alhagi LTYR-11Z中YedQ蛋白具有双鸟苷酸环化酶活性,同时确定Cra直接正调控yedQ基因的表达。通过检测胞内c-di-GMP含量发现缺失cra基因的突变体胞内c-di-GMP水平降低至正常水平的48%,说明Cra可以调节胞内c-di-GMP的水平。表型试验发现与野生型P.alhagi LTYR-11Z相比,?yed Q的运动能力增强;EPS产量降低;生物膜形成能力减弱。综合以上结果,可以得出以下结论:Cra直接与eps操纵子、ydiV、yedQ基因启动子结合并激活其转录,促进胞外多糖的产生和anti-FlhD_4C_2因子的合成,并提高胞内c-di-GMP水平,导致细菌的生物膜形成能力增强,而运动能力下降,从而增强其定殖能力。随后,本研究通过改变培养基中的碳源,发现与糖裂解环境相比,在糖异生环境中Cra的对eps操纵子、ydiV、yedQ基因转录激活作用更加明显。在EMSA实验中添加FBP降低了相应Cra-DNA复合物的形成,证明P.alhagi LTYR-11Z中Cra与eps,ydiV和yedQ的启动子的结合可以被糖酵解代谢物FBP抑制。编码6-磷酸果糖激酶的pfkA基因突变导致F6P瞬时积累,但代谢中间体如FBP的浓度下降,本研究敲除pfkA基因后,eps,ydiV和yedQ的启动子活性与野生株相比显著增强,也证明了这一观点。此外,植物根系分泌物在植物-微生物互作过程中起着重要的作用,并可能调控植物促生菌中定殖相关基因的表达,本研究发现水培14天的小麦根际分泌物可以增强Cra对其靶基因表达的激活作用。综上所述,本研究在P.alhagi LTYR-11Z中确定了Cra响应不同碳源调节胞外多糖合成,鞭毛生物合成和c-di-GMP的合成,进而调控其定殖行为的作用机制,并建立了一个模型来解释细菌中碳代谢调节因子Cra介导的定殖调控机制。本研究提出了植物内生菌响应环境中不同碳源调节其定殖行为的新策略,取得的研究成果对于今后进一步深入研究细菌的碳源依赖性定殖行为奠定基础,具有重要的理论价值和潜在应用前景。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S512.1;S182
【部分图文】：

有 22 个 CsrA 结合位点，而 CsrC 含有 9 个。csrB 和 csrC 的表达由受 CsrA 调控的 BarA-UvrY 双分子开关激活。CsrD 蛋白促进 CsrB 和 CsrC 的 RNaseE 依赖性从而调控 CsrB和 CsrC 的水平，通过刺激 BarA 的产生，导致其拮抗剂的水平增加。CsrA 通过更大的反馈途径自动调节其活性。另一个碳代谢调节因子 Cra 则可抑制参与糖酵解的基因的表达，同时激活葡糖异生基因的表达（Saier Jr and Ramseier, 1996）。 因此，Cra 对碳代谢的影响与 CsrA 相反。Cra 作为转录因子，与被调节基因启动子区域中的回文序列结合，通过与 RNA 聚合酶结合位点相对位置的不同来调节基因的表达。如果 Cra 结合于 RNA 聚合酶结合位点的上游，则 Cra 促进下游操纵子的转录；如果 Cra 结合位点与 RNA 聚合酶结合位点区域重叠或位于其下游，则 Cra 抑制该操纵子的转录（Saier Jr and Ramseier, 1996）。CsrA 和 Cra 调节的主要调控物质是磷酸果糖激酶（Pfk）。Pfk 可以磷酸化果糖-1-磷酸为果糖-1,6-二磷酸，这一反应在生理条件下是不可逆的（图 1-1B）。在大肠杆菌中，由 pfkA 基因编码的主要酶 PfkI 占总细胞磷酸果糖激酶活性的 90％（HELLINGA andEVANS, 1985）。CsrA 和 Cra 通过调节 PfkI 和第二种酶 Pps 将丙酮酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸来控制糖酵解和糖异生途径（图 1B）（Park et al., 1987）。

第一章 文献综述 15的内生细菌，具有重要的理论研究价值和潜在应用前景。在研究 Pantoea alhagi LTYR-11Z 的过程中，实验室发现转录调控因子 Cra 参与该菌的碳代谢调节和对小麦的定殖与共生抗旱。为进一步挖掘该菌促小麦抗旱的潜能，本研究选择碳代谢与定殖调控因子 cra进行深入研究，期待揭示其在菌株中的调控模式，为内生菌促作物抗旱机理研究方面提供研究思路，并为今后利用西北旱区特色内生菌资源增强作物抗旱性的农业实践提供重要参考。1.6 技术路线前期实验室已通过 Tn5 插入突变筛选到影响 Pantoea alhagi LTYR-11Z 中根定殖能力的基因 cra，对此本实验设计了包括基因敲除等一系列研究方案以期完成所需研究的目的。主要研究技术路线如下：

图 2-1 PCR 筛选突变菌株 ΔcraYR-11Z DNA 为模板设计阴性对照。+：以 pTargetF-Δcra 为Fig 2-1 PCR verification of mutant Δcrai LTYR-11Z DNAas negative control, +: pTargetF-Δcra as pos Ni-NTA 纯化柱纯化出的 Cra 蛋白。图 2-2 SDS-PAGE 分析纯化的 Cra 蛋白ombinant proteins analysis by 15% SDS-PAGE. M: protein ma
【参考文献】

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1 Luisa F.Castiblanco;George W.Sundin;;New insights on molecular regulation of biofilm formation in plant-associated bacteria[J];Journal of Integrative Plant Biology;2016年04期

本文编号：2877700