橘小实蝇性别决定及分化分子机制研究

发布时间：2020-11-22 08:25

　　 橘小实蝇(Bactrocera dorsalis)是一种危害250多种果实和蔬菜的重要农业害虫,给我国果蔬生产带来严重经济损失。昆虫具有多种多样的性别决定机制,不仅不同昆虫通过不同的基因和调控机制决定性别分化,甚至在同种昆虫不同品系之间性别决定机制也不尽相同。昆虫中决定性别的初始染色体信号差异较大,其中最典型的是Y染色体连接的雄性决定因子(M factor)决定雄性性别发育。但是,在包括橘小实蝇在内的多种昆虫中,假定的M因子还是未知的。本研究以橘小实蝇为研究对象,利用RNA干扰(RNAi)、CRISPR/Cas9编辑系统和高通量测序技术等分子生物学手段,研究了橘小实蝇性别决定关键基因transformer的功能;鉴定出一种小分子micro RNA作为雄性决定因子调控橘小实蝇早期胚胎性别分化;鉴定和研究了多种橘小实蝇性别偏向性microRNAs在两性发育中的作用;验证了保守性Let-7调控橘小实蝇发育过程。对橘小实蝇性别决定分子机制的研究,不仅为探索昆虫性别分化通路上类似基因的功能,以及确定新的性别决定基因提供参考,而且为昆虫的遗传操作提供理论和实践基础。本研究为发展不依赖辐射处理的不育害虫防治技术(SIT)提供了新的策略。1.Transformer基因是昆虫性别决定级联系统中的一个双开关基因,通过选择性剪切来实现性别分化。为阐明性别决定关键基因在调控雌雄分化和雌虫繁殖力中的功能,我们分离鉴定了橘小实蝇transformer和transformer-2,Bdtra经过选择性剪切转录产生两种雄特异和一种雌特异的亚型,雌特异的亚型能翻译成有功能的TRA蛋白,而雄特异的亚型由于终止密码子不能翻译成有功能的TRA蛋白。Bdtra上存在的TRA/TRA-2结合位点表明,TRA和TRA-2作为剪切调控因子通过Bdtra反馈调节来维持和促进雌性的性别发育。早期胚胎发育过程中雌特异tra的表达模中tra-f在15小时达到高表达。通过RNA干扰对Bdtra进行了功能研究,发现胚胎期敲除Bdtra基因能导致雌虫雄性化,表明橘小实蝇在胚胎早期实现性别分化;成虫期敲除Bdtra基因能降低雌虫卵黄蛋白基因yolk protein gene(Bdyp1)的表达,进而降低雌虫产卵量,表明Bdtra基因能正向调控卵黄蛋白基因Bdyp1的转录。这些结果表明利用性别决定关键基因构建转基因性别品系,通过释放竞争力更强的不育雄虫后代,能够提高昆虫不育技术对橘小实蝇的防治。2.MicroRNAs(miRNAs)是一类小的内源非编码RNAs,能够调控包括两性异形在内的多种生理过程。然而,至今没有对橘小实蝇雌雄成虫和生殖腺中miRNAs进行鉴定以及对miRNAs在性腺分化中的作用进行阐述。我们通过对橘小实蝇性成熟雌虫、雄虫、卵巢和精巢构建small RNA文库,测序数据分析鉴定出183个已知和120个新miRNAs。对4个文库中miRNAs表达量进行比较分析,发现18个雌性偏向表达和16个雄性偏向表达miRNAs,这些性别偏向性miRNAs可能参与性别分化。通过靶标基因软件预测分析,发现雌偏向性miR-989-3p靶向实蝇科昆虫性别决定关键基因doublesex(dsx),这表明miR-989-3p可能参与调控橘小实蝇性别分化。对雌成虫饲喂miR-989-3p、miR-994-5p、miR-309-3p和miR-6-3p抑制剂促进产卵量的增加,对雄成虫饲喂miR-8-3p、miR-34-5p、miR-1-3p和miR-12-5p抑制剂使得雄虫交配竞争力下降,对雌雄成虫饲喂以上抑制剂都降低了成虫存活寿命。这些结果表明性别偏向性miRNAs在维持雌雄生殖力和寿命中起着重要作用。本研究首次揭示了橘小实蝇性别分化相关的miRNAs的表达模式,发现miRNAs在性别间差异表达,这将促进生殖器官特异表达miRNAs的功能研究。3.在一些实蝇科昆虫中,Y染色体连接的雄性决定因子(M factor)启动性别决定途径中的基本信号。然而,橘小实蝇中M因子及其性别决定分子机制还尚不明确。在本研究中,我们鉴定到橘小实蝇早期胚胎雄性性别发育关键时期是产卵后5、6和7小时,对5、6和7小时胚胎构建small RNA文库,鉴定出65个胚胎差异表达miRNAs。在这些miRNAs中,有8个和Bdtra基因3?非编码端(3?UTR)序列有碱基互补配对结合位点,其中结合自由能最低的是miR-1-3p。在HEK293T细胞中进行的双荧光素酶实验表明miR-1-3p能抑制Bdtra的表达。胚胎注射miR-1-3p类似物和抑制剂分别下调62%和上调109%的Bdtra表达量,体外和体内实验表明Bdtra是miR-1-3p的靶标基因。另外,胚胎注射miR-1-3p类似物导致后代雄性化(92%的雄性后代表型),注射miR-1-3p抑制剂能导致后代雌性化(77%的雌性后代表型)。利用CRISPR/Cas9技术敲除miR-1-3p导致突变雄性个体完全逆转为雌性表型,且Bdtra和Bddsx基因进行雌性特异剪切表达,这些结果表明miR-1-3p对橘小实蝇早期胚胎雄性性别决定是必需的,miR-1-3p作为雄性决定因子中间体,可能受到Y染色体连接的基本信号的激活,参与性别调控。4.MicroRNAs(miRNAs)调控昆虫发育中多种生理过程,但是miRNAs在橘小实蝇幼虫至蛹期发育中的作用还是未知的。在本研究中,利用在HEK293T细胞中的双荧光素酶实验,我们发现Bdo-Let-7作用于Bd E75基因的3?非编码端(3?UTR),抑制Bd E75基因的表达。Bdo-Let-7和Bd E75在幼虫至蛹期发育过程和不同组织中是共表达的。对三龄幼虫注射Bdo-Let-7类似物和抑制剂分别下调62%和上调94%的Bd E75表达量。对第五天幼虫注射20-羟基蜕皮酮(20E)3、12、24和48小时后,Bdo-Let-7表达量分别上调82%、91%、110%和144%。另外,注射Bdo-Let-7抑制剂后观察到幼虫异常的化蛹和羽化现象。依据以上结果,我们证实Bdo-Let-7调控蜕皮激素信号途径基因Bd E75的正常剂量表达,从而维持橘小实蝇幼虫至蛹期的正常发育。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S433
【部分图文】：

Nix 基因是 transformer-2 (tra-2)基因的同源基因（图1.3）。图 1.3 蚊子中性别决定途径Figure 1.3 The sex determination pathway in mosquito (Sinkins 2016)1.2 昆虫性别决定 transformer 基因1.2.1 Transformer 基因概括Transformer 基因在包括双翅目昆虫如实蝇科、家蝇科、膜翅目、鞘翅目昆虫中高度保守，在性别决定机制中作为关键因子调控性别分化(Verhulst et al 2010b;Gempe and Beye 2011)。地中海实蝇 C. capitata (Pane et al 2002)、橄榄果实蝇Bactrocera oleae (Lagos et al 2007)、铜绿蝇 Lucilia cuprina (Concha and Scott 2009)、加勒比按实蝇Anastrepha suspensa (Schetelig et al2012)、昆士兰实蝇Bactrocera tryoni和扎氏果实蝇 Bactrocera jarvisi (Morrow et al 2014) tra 基因都含有雄性特异的外显子，上面有使转录停止的终止密码子，在雄虫中转录产生无功能的 TRA蛋白。在雌虫中，雄性特异的外显子被剪切掉而产生有功能的 TRA 蛋白。这些实蝇科物种 tra基因组结构和性别特异性剪切是相似的，雄性特异外显子上都有 TRA/TRA-2 结合位点，表明在这些物种中都存在一个自动调节机制来维持 tra 的雌性特异表达（图

图 1.4 实蝇科物种 transformer 基因结构比较 1.4 Comparison of the organization of transformer genes from tephritid speciesand Scott 2009)家蝇中，Mdtra 基因有活力时指导雌性分化，而无活力时指导雄er et al 2010; Sharma et al 2017)。在翅拟谷盗 Tribolium castaneum 和a vitripennis 中，tra 基因通过调控 dsx 基因性别特异剪切方式控制雌性hulstet al 2010a;Shukla and Palli 2012a)。在地中海实蝇中，胚胎干扰雌性个体转化为可育雄性个体(Pane et al 2002)。在其它双翅目、膜翅虫中，胚胎期 tra 干扰实验也导致雌性个体不同程度雄性化，且雄性影响(Beye et al 2003; Lagos et al 2007; Hediger et al 2010; Schetelig et and Palli 2012a)。尽管昆虫中 tra 基因的核苷酸序列和氨基酸组分差们作为dsx 基因性别特异性剪切调控因子的功能是保守的。在雄虫中特异的选择性剪切产生含有终止密码子的转录本，从而产生无功能的

图 1.7 三类主要的调控小 RNAsFigure 1.7 Three main classes of regulatory small RNAs (Lucas et al 2013)1 MicroRNAs 生物合成和调控机制microRNAs (miRNAs)是转录后基因表达的调控者，在进化上高度保守，在长发育过程中发挥重要的调控作用。编码 miRNA 的基因首先在细胞核 聚合酶 II 转录成初始 miRNA (primary miRNA, pri-miRNA)，接着被 RNrosha 剪切为长度约 70-90 nt 发夹结构的前体 miRNA (precursor mmiRNA)，随即在核质/细胞质转运蛋白(Exportin-5)的携带下从核内转运到被 RNase III 内切酶 Dicer-1 将其末端茎环结构切除，产生长 22 nt 剪切NA:miRNA 双链复合体，miRNA 二倍体结合到 Argonaute (Ago)蛋白上，进进入 RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)，其中一单链 miRNA 被保留下来，通过与靶标基因 mRNA 的 3 非编码端(untra
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本文编号：2894407