青枯劳尔氏菌EP-1胞外多糖合成缺陷突变体筛选及生物学特征研究

发布时间：2017-04-11 08:05

  本文关键词：青枯劳尔氏菌EP-1胞外多糖合成缺陷突变体筛选及生物学特征研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum),又称青枯菌,起初命名为青枯假单胞杆菌(Pseudomonas solanacearum),革兰氏阴性菌,是一种土传植物细菌性青枯病的病原菌。青枯菌环境适应性强、寄主范围广,可危害40多个科的数百种植物,严重影响作物产量,对农业生产危害巨大。本实验利用广东地区常见的强毒力青枯菌菌株EP-1构建Tn5插入突变体库,在24,500个克隆中筛选得到15个胞外多糖明显减少的突变体,利用hiTAIL-PCR方法获得突变基因的全序列,通过酶活生物测定、生物膜检测、运动性检测和接种试验分析突变体的表型与致病性,进一步利用qRT-PCR技术分析相关基因表达量的差异,为进一步研究青枯菌胞外多糖致病性及调控机理和构建快速鉴定青枯菌致病力强弱的方法奠定基础。结果如下:1.筛选得到的15个胞外多糖明显减少的突变体,分别命名为Em2、Em3、Em4、Em28、Em29、Em31、Em32、Em36、Em37、Em51、Em56、Em58、Em60、Em61和Em64。另外,获得青枯菌菌株EP-1、GMI1000、从番茄和花生分离得到的TM-1和PN-1菌株分别传代培养至60代、25代和30代得到EP-60、GMI1000-25、TM-30和PN-30。2.通过hiTAIL-PCR方法确定突变体插入基因位点。比对分析表明,突变体Em2、Em3、Em4、Em29、Em31和Em37突变在相同基因phcA的不同位点,该基因全长1044bp,编码347个氨基酸,是青枯菌致病性调控网络的核心调控因子;突变体Em28突变在基因epsB中,该基因全长2256bp,编码751个氨基酸,位于调控网络下游,与其胞外多糖的分泌密切相关;突变体Em32突变在基因CMR15-30160中,该基因全长690bp,编码229个氨基酸,具体功能未知;突变体Em36突变在基因gstO中,该基因全长690bp,编码229个氨基酸,与谷胱甘肽转移酶的合成有关;突变体Em51突变在基因pstS2中,该基因全长1062bp,编码353个氨基酸,可能与磷酸盐结合的周质前体ABC转运蛋白的的合成有关;突变体Em56突变在基因asd中,该基因全长1104bp,编码367个氨基酸,可能与天冬氨酸半醛脱氢酶氧化还原有关;突变体Em58突变在基因RSc1351中,该基因全长1245bp,编码414个氨基酸,可能是组氨酸激酶跨膜转录调控蛋白感受器;突变体Em60突变在基因RSc1584中,该基因全长441bp,编码146个氨基酸,推测为假定转录调控因子;突变体Em61突变在基因RSc1620中,该基因全长243bp,编码80个氨基酸,是假定跨膜蛋白;突变体Em64突变在基因pckG中,该基因全长1869bp,编码622个氨基酸,可能是磷酸羧化酶蛋白。3.通过qRT-PCR检验分析表明,突变基因导致EP-1胞外多糖相关基因和编码群体感应信号基因phcB的表达量降低;接种寄主植物表明致病性减弱,还对运动性及生物膜的形成产生影响。4.初步建立了鉴定青枯菌致病力分化的检测方法。基于对得到的胞外多糖合成缺陷突变体的分析结果,或许可以选取基因phcA、gstO、RSc1351和RSc1584为靶标,通过分析基因表达量的变化,从而评估青枯菌菌株致病力强弱。
【关键词】：青枯菌 Tn5突变体库 胞外多糖 毒力因子 致病性
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S432.42
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 缩写词和英汉对照表7-11
• 1 前言11-17
• 1.1 青枯菌病害的概况11-12
• 1.1.1 青枯菌及其危害性11
• 1.1.2 青枯菌对植物的侵染过程11-12
• 1.2 青枯菌病害的研究进展12-15
• 1.2.1 青枯菌的致病因子12-13
• 1.2.2 青枯菌致病性调控机理13-15
• 1.3 青枯菌中的群体感应（QS）系统15
• 1.4 青枯菌基因组与致病性的关系15-16
• 1.5 青枯菌致病性强弱菌株鉴定方法研究进展16-17
• 1.6 本研究的内容、目的和意义17
• 2 材料与方法17-32
• 2.1 实验材料及仪器设备17-20
• 2.1.1 菌株和质粒的来源17-18
• 2.1.2 主要试剂和其他材料18
• 2.1.3 培养基及溶液的配制18-19
• 2.1.4 主要仪器及设备19-20
• 2.2 EP-1 Tn5插入突变体库的构建20
• 2.2.1 双亲杂交20
• 2.2.2 突变体的筛选20
• 2.3 突变体转座子插入检验20-22
• 2.3.1 青枯菌特异性检测20-21
• 2.3.2 Tn5转座子插入检测21-22
• 2.4 确定Tn5转座子插入位置22-28
• 2.4.1 青枯菌基因组的提取22
• 2.4.2 hiTAIL-PCR扩增获得目的基因序列22-25
• 2.4.3 目的片段的回收25-26
• 2.4.4 PCR产物的连接反应26
• 2.4.5 连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α26-27
• 2.4.6 阳性重组转化子的鉴定27
• 2.4.7 Tn5插入区侧翼序列分析27-28
• 2.4.8 对目的基因进行分子生物学和生物信息学的鉴定与分析28
• 2.6 表型分析及生长曲线的测定28
• 2.6.1 纤维素酶检测28
• 2.6.2 生物膜检测28
• 2.6.3 运动性检测28
• 2.6.4 生长曲线的测定28
• 2.7 致病性分析28-29
• 2.8 基因表达和调控分析29-32
• 2.8.1 细菌RNA的提取29-30
• 2.8.2 总RNA的纯度和完整性检测30
• 2.8.3 反转录反应30-31
• 2.8.4 qRT-PCR31-32
• 3 结果与分析32-45
• 3.1 EP-1 Tn5插入突变体库的构建32-33
• 3.1.1 双亲杂交获得突变体32-33
• 3.1.2 突变体的筛选33
• 3.2 突变体插入检测33-34
• 3.3 hiTAIL-PCR扩增获得目的基因序列34-40
• 3.3.1 hiTAIL-PCR产物的电泳检测34
• 3.3.2 阳性重组转化子的鉴定34-35
• 3.3.3 Tn5插入区侧翼序列分析35-37
• 3.3.4 分子生物学和生物信息学分析37-40
• 3.4 表型分析及生长曲线的测定40-43
• 3.4.1 纤维素酶检测40-41
• 3.4.2 生物膜检测41
• 3.4.3 运动性检测41-42
• 3.4.4 生长曲线的测定42-43
• 3.5 致病性分析43
• 3.6 基因表达和调控分析43-45
• 3.6.1 细菌RNA电泳检测43-44
• 3.6.2 群体感应基因表达量分析44
• 3.6.3 鉴定致病力分化菌株方法的探索44-45
• 4 结论与讨论45-49
• 4.1 结论45-46
• 4.2 讨论46-49
• 4.2.1 青枯菌胞外多糖突变及筛选体系的建立46-47
• 4.2.2 胞外多糖及其相关基因与青枯菌致病性的关系47
• 4.2.3 快速鉴定青枯菌致病力方法的构建47-48
• 4.2.4 有待深入研究的内容48-49
• 致谢49-50
• 参考文献50-54
• 附录54-58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 马健尧;李焕秀;李立佼;谭华强;张莉;铁曼曼;;番茄青枯雷尔氏菌强致病力菌株变异的研究[J];广西植物;2014年04期

2 徐进;冯洁;;植物青枯菌遗传多样性及致病基因组学研究进展[J];中国农业科学;2013年14期

3 乔俊卿;陈志谊;刘邮洲;刘永锋;梁雪杰;张磊;;茄科作物青枯病研究进展[J];植物病理学报;2013年01期

4 刘蕾;徐进;许景升;陈匡宇;张丽R，

本文编号：298648