列当生防菌Br-2的DsRed红色荧光标记及定殖
发布时间：2021-01-30 02:14
为探明生防菌Br-2在分枝列当体内及番茄根围的定殖能力,采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化体系将红色荧光蛋白基因DsRed转入到菌株Br-2中,并构建其生长曲线,测定其对分枝列当种子萌发的抑制率,通过共聚焦显微镜观察其在分枝列当茎内及番茄根围的定殖情况。结果表明:通过原生质体转化体系得到了标记菌株Br-2-DsRed,继代培养5代后,其在共聚焦显微镜下仍可观察到亮红色荧光,经PCR检测带有DsRed基因,证明其稳定性好。标记菌株Br-2-DsRed与野生菌株Br-2的生长曲线基本一致,对分枝列当种子萌发的抑制率分别为75.86%和74.14%,无显著差异。显微观察发现,标记菌株Br-2-DsRed接种1 d后即能够侵染分枝列当的茎部表皮,3 d后主要分布在茎表皮和厚壁细胞间隙,5 d后侵染到厚壁细胞及维管束细胞内部并导致茎部腐烂;而标记菌株Br-2-DsRed不能侵染番茄根尖的内部,主要定殖在番茄根尖表面。
【文章来源】：植物保护学报. 2017,44(04)北大核心
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
红色荧光蛋白标记菌株Br-2-DsRed的稳定性分析及验证Fig.1StabilityanalysisandverificationofBr-2-DsRedstainlabeledwithredfluorescentprotein
oteinA：Br-2-DsRed菌丝形态；B：Br-2-DsRed孢子形态；C：转化子中DsRed的PCR检测；M：DNA分子量标准；1~3：标记菌株Br-2-DsRed基因组；4：质粒PRHN1；5：野生菌株Br-2基因组。A：MorphologiesofBr-2-DsRedmycelium；B：morpholo-giesofBr-2-DsRedconidiogenouscells；C：detectionofDsRedgeneintransformantgenomesbyPCRamplification；M：DNAmarker；1-3：genomicDNAofBr-2-DsRed；4：plasmidPRHN1；5：genomicDNAofBr-2.2.2标记菌株的生长曲线野生菌株Br-2和标记菌株Br-2-DsRed的生长趋势基本相同，生长曲线基本重合（图2）。菌株在培养1~4d为分生孢子的对数生长期，5~9d为稳定生长期，表明野生菌株Br-2进行红色荧光蛋白标记后，外源质粒PRHN1的存在和红色荧光蛋白的表达对菌株Br-2的生长无明显影响。图2野生菌株Br-2和标记菌株Br-2-DsRed的生长曲线Fig.2ThegrowthcurveofwildstainBr-2andlabeledstainBr-2-DsRed图中数据为平均数±标准差。Dataaremean±SD.2.3标记菌株对分枝列当种子萌发的影响将野生菌株Br-2和标记菌株Br-2-DsRed孢子悬浮液加入到萌发培养的分枝列当种子中，结果发现2个菌株均能够显著抑制分枝列当种子的萌发，萌发率分别为25.00%和23.33%，均显著低于对照（表1）。野生菌株Br-2对分枝列当种子萌发的抑制率为74.14%，标记菌株Br-2-DsRed的抑制率为75.86%，二者间无显著差异。表明野生菌株Br-2进行红色荧光蛋白标记后，对分枝列当种子的抑制作用并未受到不利影响。表1野生菌株Br-2和标记菌株Br-2-DsRed对分枝列当种子萌发的抑制作用Table1TheinhibitingeffectofBr-2andstainBr-2-DsRedongerminationofOrobancheaegyptiacaseed%菌株StrainBr-2Br-2-DsRed对照CK萌发率Sproutingrate25.00±2.
细胞和厚壁细胞间隙的标记菌株Br-2-DsRed侵染到细胞内部，维管束和薄壁细胞内分布有大量的Br-2-DsRed菌株，并且细胞开始降解，且茎部细胞逐渐降解并出现腐烂状态（图3-D）。共聚焦显微镜观察标记菌株Br-2-DsRed在番茄根尖的定殖情况发现，接种1~15d后Br-2-DsRed菌株在番茄根部的分布情况一致，主要分布在番茄根尖的表面，并不能侵染到根尖的内部（图4）。图3共聚焦显微镜观察标记菌株Br-2-DsRed在分枝列当茎部的定殖情况Fig.3ColonizationimagesofBr-2-DsRedinOrobancheaegyptiacastembytheconfocalmicroscopeA：对照；B~D：接种1、3、5d后Br-2-DsRed菌株分布情况。A：Control；B-D：colonizationimagesofBr-2-DsRedafterin-oculationof1，3，5d.图4标记菌株Br-2-DsRed在番茄根尖的定殖情况Fig.4ColonizationimagesofBr-2-DsRedontomatoroottipbyconfocalmicroscopeA：对照；B：根表面；C：根内部。A：Control；B：rootsurface；C：rootinternal.3讨论生防微生物在植株中定殖、扩散和生存竞争能力是评价其生防潜能的一个重要方面。而DsRed标记技术能够实时、原位研究微生物的空间定殖、微生物与环境及宿主的互作，在研究定殖规律方面具有良好的应用前景（Sarroccoetal.，2007）。但是在对菌株进行荧光标记时，荧光基因的表达是在宿主菌668植物保护学报44卷
【参考文献】：
期刊论文
[1]枯草芽胞杆菌PTS-394的GFP标记及其定殖能力[J]. 刘邮洲,梁雪杰,乔俊卿,张荣胜,陈志谊. 植物保护学报. 2014(04)
[2]溶杆菌SNNU513基因gfp标记及在玉米根部定殖[J]. 武坤毅,王斐斐,崔浪军,章华伟,白成科. 中国生物防治学报. 2014(01)
[3]尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种红色荧光蛋白基因转化[J]. 谢德啸,羊玉花,周端咏,郭立佳,彭军,黄小娟,齐兴柱,黄俊生. 热带作物学报. 2012(04)
[4]短短芽孢杆菌JK-2的GFP标记及其抑菌作用[J]. 车建美,刘波,蓝江林. 中国生物防治. 2010(02)
[5]链格孢菌原生质体的制备与限制性内切酶介导整合（REMI）转化的致病性诱变[J]. 伏建国,强胜,朱云枝. 菌物学报. 2005(03)
本文编号：3008038
【文章来源】：植物保护学报. 2017,44(04)北大核心
【文章页数】：7 页
【部分图文】：
红色荧光蛋白标记菌株Br-2-DsRed的稳定性分析及验证Fig.1StabilityanalysisandverificationofBr-2-DsRedstainlabeledwithredfluorescentprotein
oteinA：Br-2-DsRed菌丝形态；B：Br-2-DsRed孢子形态；C：转化子中DsRed的PCR检测；M：DNA分子量标准；1~3：标记菌株Br-2-DsRed基因组；4：质粒PRHN1；5：野生菌株Br-2基因组。A：MorphologiesofBr-2-DsRedmycelium；B：morpholo-giesofBr-2-DsRedconidiogenouscells；C：detectionofDsRedgeneintransformantgenomesbyPCRamplification；M：DNAmarker；1-3：genomicDNAofBr-2-DsRed；4：plasmidPRHN1；5：genomicDNAofBr-2.2.2标记菌株的生长曲线野生菌株Br-2和标记菌株Br-2-DsRed的生长趋势基本相同，生长曲线基本重合（图2）。菌株在培养1~4d为分生孢子的对数生长期，5~9d为稳定生长期，表明野生菌株Br-2进行红色荧光蛋白标记后，外源质粒PRHN1的存在和红色荧光蛋白的表达对菌株Br-2的生长无明显影响。图2野生菌株Br-2和标记菌株Br-2-DsRed的生长曲线Fig.2ThegrowthcurveofwildstainBr-2andlabeledstainBr-2-DsRed图中数据为平均数±标准差。Dataaremean±SD.2.3标记菌株对分枝列当种子萌发的影响将野生菌株Br-2和标记菌株Br-2-DsRed孢子悬浮液加入到萌发培养的分枝列当种子中，结果发现2个菌株均能够显著抑制分枝列当种子的萌发，萌发率分别为25.00%和23.33%，均显著低于对照（表1）。野生菌株Br-2对分枝列当种子萌发的抑制率为74.14%，标记菌株Br-2-DsRed的抑制率为75.86%，二者间无显著差异。表明野生菌株Br-2进行红色荧光蛋白标记后，对分枝列当种子的抑制作用并未受到不利影响。表1野生菌株Br-2和标记菌株Br-2-DsRed对分枝列当种子萌发的抑制作用Table1TheinhibitingeffectofBr-2andstainBr-2-DsRedongerminationofOrobancheaegyptiacaseed%菌株StrainBr-2Br-2-DsRed对照CK萌发率Sproutingrate25.00±2.
细胞和厚壁细胞间隙的标记菌株Br-2-DsRed侵染到细胞内部，维管束和薄壁细胞内分布有大量的Br-2-DsRed菌株，并且细胞开始降解，且茎部细胞逐渐降解并出现腐烂状态（图3-D）。共聚焦显微镜观察标记菌株Br-2-DsRed在番茄根尖的定殖情况发现，接种1~15d后Br-2-DsRed菌株在番茄根部的分布情况一致，主要分布在番茄根尖的表面，并不能侵染到根尖的内部（图4）。图3共聚焦显微镜观察标记菌株Br-2-DsRed在分枝列当茎部的定殖情况Fig.3ColonizationimagesofBr-2-DsRedinOrobancheaegyptiacastembytheconfocalmicroscopeA：对照；B~D：接种1、3、5d后Br-2-DsRed菌株分布情况。A：Control；B-D：colonizationimagesofBr-2-DsRedafterin-oculationof1，3，5d.图4标记菌株Br-2-DsRed在番茄根尖的定殖情况Fig.4ColonizationimagesofBr-2-DsRedontomatoroottipbyconfocalmicroscopeA：对照；B：根表面；C：根内部。A：Control；B：rootsurface；C：rootinternal.3讨论生防微生物在植株中定殖、扩散和生存竞争能力是评价其生防潜能的一个重要方面。而DsRed标记技术能够实时、原位研究微生物的空间定殖、微生物与环境及宿主的互作，在研究定殖规律方面具有良好的应用前景（Sarroccoetal.，2007）。但是在对菌株进行荧光标记时，荧光基因的表达是在宿主菌668植物保护学报44卷
【参考文献】：
期刊论文
[1]枯草芽胞杆菌PTS-394的GFP标记及其定殖能力[J]. 刘邮洲,梁雪杰,乔俊卿,张荣胜,陈志谊. 植物保护学报. 2014(04)
[2]溶杆菌SNNU513基因gfp标记及在玉米根部定殖[J]. 武坤毅,王斐斐,崔浪军,章华伟,白成科. 中国生物防治学报. 2014(01)
[3]尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种红色荧光蛋白基因转化[J]. 谢德啸,羊玉花,周端咏,郭立佳,彭军,黄小娟,齐兴柱,黄俊生. 热带作物学报. 2012(04)
[4]短短芽孢杆菌JK-2的GFP标记及其抑菌作用[J]. 车建美,刘波,蓝江林. 中国生物防治. 2010(02)
[5]链格孢菌原生质体的制备与限制性内切酶介导整合（REMI）转化的致病性诱变[J]. 伏建国,强胜,朱云枝. 菌物学报. 2005(03)
本文编号：3008038
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