多杀菌素生物合成基因簇的异源表达及刺糖多孢菌遗传转化
发布时间：2021-03-24 07:31
多杀菌素是土壤放线菌刺糖多孢菌经有氧发酵产生的胞内次级代谢产物,具有较高的杀虫活性。因其兼具生物农药的安全性和化学农药的速效性,在防治农作物害虫和储粮害虫方面有良好的应用价值和广阔的市场前景。关于刺糖多孢菌分子水平改造的报道很少,其主要原因是刺糖多孢菌具有很强的限制修饰系统,外源DNA很难导入。在刺糖多孢菌生长缓慢、遗传转化困难的情况下,选择遗传背景清晰、生长迅速、发酵技术成熟的链霉菌作为异源宿主,对多杀菌素合成基因簇进行异源表达,有望提高多杀菌素产量,并研究其表达调控的机理。通过构建刺糖多孢菌BAC文库,获得了含有完整spn基因簇的pCC1BAC质粒。将大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pSET152上接合转移所需的相关基因和参与多杀菌素合成的鼠李糖合成基因通过Red/ET插入到含有spn基因簇的BAC质粒上,构成了异源表达质粒。以天蓝色链霉菌、变铅青链霉菌等链霉菌作为异源宿主菌,成功地构建了产多杀菌素的基因工程菌。进一步对刺糖多孢菌进行遗传改造和调控基因研究,建立并优化了刺糖多孢菌的接合转移方法。工业上所用的培养基的碳源主要是淀粉类物质,但是刺糖多孢菌对淀粉的利用效率很低。研究表明,菌体对淀...
【文章来源】：福建农林大学福建省
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－４多杀菌素Ｉ型聚酮合成酶（ＰＫＳ）结构图％??Ｆｉｇ?１－４?Ｍｏｄｕｌａｒ?ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?Ｓｐｉｎｏｓｙｎ?ＰＫＳ?ｇｅｎｅ?ｃｌｕｓｔｅｒ??
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福建农林大学硕士学位论文??诱导ｐＲｅｄＥＴ?（ａｍｐ）上ｒｅｄ基因表达。３０°Ｃ震荡培养４ｈ?ＯＤ６００达到０．５左右，按??上述方法制备ＢＷ２５１１３?ｐＲｅｄＥＴ?（ａｍｐ）?ＢＡＣ－ｓｐｎ感受态细胞，５０?ｕ?Ｌ感受态细??胞与２?ｙ?Ｌ的１５２片段混合进行电转化，悬浮液涂布于含有２５?ｕｇ／ｍＬ四环素及??１００ｕｇ／ｍＬ安普霉素的ＬＢ平板上，３７°Ｃ过夜培养。挑取若干单克隆，进行ＰＣＲ??验证，对可扩增出４．３?ｋｂ条带的克隆提取ＢＡＣ质粒进行测序，完成ＢＡＣ－ｓｐｎ－１５２??的构建及确认。??＼??＇?一?ＢＡ——丨，??４?ＰＣＲ??ｈｍｌ?－？?／－ｈｍ２??ａａｃ（３）ＩＶ＾?＇－＾ｉｐ?＾－ｉｎｌ＇??％一?＼??ＢＡＣ－ｊｐｎ－１５２?Ｖ??％：二?１）??图２－２含有基因簇的接合转移型质粒ＢＡＣ－ｓ／？ｉ－１５２的构建??Ｆｉｇ?２－２?Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ＢＡＣ－５／？ｗ－１５２??２．２．２１?ＢＡＣ－ｉ＾－１５２－ｒＡａ?的构建??引物设计??根据ＮＣＢＩ可获得印／、知ｅ、开放阅读框及上游序列信息，通过生物??信息学可分析其ＲＢＳ?（核糖体结合位点）及启动子区域，由此设计３对引物分??别扩增含有吻、ｇＷＡｒｅ、ｇＭ的ＲＢＳ及编码区片段。??正向序列?ｅｐｉ－Ｆ：?ＧＴＣＡＧＧＡＴＣＣ?４９４６０ＣＡＡＣＧＴＣＡＴＡＧＧＣＴＴＴＣＧＧＣ?（下??划线碱基为限制性内切酶ＢａｍＨＩ识别位点）??反向序列?ｅｐｉ－Ｒ：?ＧＴＣＡＴＣＴＡＧＡＧＣＴＴＧＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＴＣＡＧＣ?（下划线碱??基为限制性内切酶Ｘｂａｌ识别位点）??３２??
【参考文献】：
期刊论文
[1]多杀菌素高产菌株的选育[J]. 贺玉平,戴经元,代鹏,胡西洲,林开春. 中国生物防治. 2006(01)
[2]多杀菌素生产菌株的选育[J]. 代鹏,徐雪莲,贺玉平,戴经元,林开春,黄俊生. 热带作物学报. 2005(04)
[3]多杀菌素的生物合成[J]. 苏建亚,沈晋良. 中国生物工程杂志. 2003(05)
硕士论文
[1]多杀菌素产生菌菌种选育及原生质体制备[D]. 程休.浙江大学 2006
本文编号：3097337
【文章来源】：福建农林大学福建省
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－４多杀菌素Ｉ型聚酮合成酶（ＰＫＳ）结构图％??Ｆｉｇ?１－４?Ｍｏｄｕｌａｒ?ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?Ｓｐｉｎｏｓｙｎ?ＰＫＳ?ｇｅｎｅ?ｃｌｕｓｔｅｒ??
－ｒａｃｅ?ＰＣＲ实验结果，刺糖多孢菌的??生物合成基因簇共有９个转录子，转录子结构如图所示。??５２ｂｐ?２?３３１?８?２０３?１３?５?４５４?１７?３４?３６２??＼?ｆ＼Ｌ?｜＼ｈ?（Ｋｆ?Ａ?＼?（：?＼?Ｅ?＼?Ｒ２???？??？???＾?七??６＾４?１?＞１６、５、４?＼、９?＼ｌ５?Ｒ?＾４?Ｄ?、〇?Ｒ１、２。??＂Ｔ?一?￣￣１—＂Ｖ＂—?￣ｖｎ?一ｌｘ＂??一?ｘｉｌＴ??ＩＩ?ＩＶ?ｖｉ?ＶＩＩＩ?Ｘ?ＸＩ?ＸＩＩ??图２－１多杀菌素生物合成基因簇转录子结构分析??Ｆｉｇ?２－１?Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｓｐｉｎｏｓｙｎ?ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｃｌｕｓｔｅｒ??（黑色箭头表示了?．Ｖｍ基因簇中各个基因的大小和方向，阿拉伯数字表示了各个基因之间的距离，红色线??条代表了转录子结构）??根据ＮＣＢＩ上刺糖多孢菌生物合成基因簇的序列信息，设计扩增５／７／７基因簇??每个转录子中的１００－１５０ｂｐ大小的片段，退火温度在均在６０°Ｃ以上。对于多顺反??子，用位于转录子中部的基因的转录水平来代表整个转录子的转录水平。设计引??物序列：??表２－３ＲＴ－ＰＣＲ引物??Ｔａｂｌｅ?２－３?Ｐｒｉｍｅｒｓ?ｆｏｒ?ＲＴ－ＰＣＲ??Ｐｒｉｍｅｒ?Ｐｒｉｍｅｒ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ?（?５＇—＾３＇）??ｓｐｎＰ－Ｆ?ＣＧＣＣＴＧＣＣＴＧＴＧＧＡＣＴＴＧＧＡ??ｓｐｎＰ－Ｒ?ＴＧＣＴＣＡＧＣＣＧＣＣＧＣＴＴＧＧＴＣ??ｓｐｎＭ－Ｆ?ＡＴＣＴＣＧＴＣＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＴＧ??ｓｐｎＭ－Ｒ?ＧＣＧＡＣＴＴＣＣＴＣＧＡＣＡＣＴＴＣＣ??ｓｐｎｌ－Ｆ
福建农林大学硕士学位论文??诱导ｐＲｅｄＥＴ?（ａｍｐ）上ｒｅｄ基因表达。３０°Ｃ震荡培养４ｈ?ＯＤ６００达到０．５左右，按??上述方法制备ＢＷ２５１１３?ｐＲｅｄＥＴ?（ａｍｐ）?ＢＡＣ－ｓｐｎ感受态细胞，５０?ｕ?Ｌ感受态细??胞与２?ｙ?Ｌ的１５２片段混合进行电转化，悬浮液涂布于含有２５?ｕｇ／ｍＬ四环素及??１００ｕｇ／ｍＬ安普霉素的ＬＢ平板上，３７°Ｃ过夜培养。挑取若干单克隆，进行ＰＣＲ??验证，对可扩增出４．３?ｋｂ条带的克隆提取ＢＡＣ质粒进行测序，完成ＢＡＣ－ｓｐｎ－１５２??的构建及确认。??＼??＇?一?ＢＡ——丨，??４?ＰＣＲ??ｈｍｌ?－？?／－ｈｍ２??ａａｃ（３）ＩＶ＾?＇－＾ｉｐ?＾－ｉｎｌ＇??％一?＼??ＢＡＣ－ｊｐｎ－１５２?Ｖ??％：二?１）??图２－２含有基因簇的接合转移型质粒ＢＡＣ－ｓ／？ｉ－１５２的构建??Ｆｉｇ?２－２?Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ＢＡＣ－５／？ｗ－１５２??２．２．２１?ＢＡＣ－ｉ＾－１５２－ｒＡａ?的构建??引物设计??根据ＮＣＢＩ可获得印／、知ｅ、开放阅读框及上游序列信息，通过生物??信息学可分析其ＲＢＳ?（核糖体结合位点）及启动子区域，由此设计３对引物分??别扩增含有吻、ｇＷＡｒｅ、ｇＭ的ＲＢＳ及编码区片段。??正向序列?ｅｐｉ－Ｆ：?ＧＴＣＡＧＧＡＴＣＣ?４９４６０ＣＡＡＣＧＴＣＡＴＡＧＧＣＴＴＴＣＧＧＣ?（下??划线碱基为限制性内切酶ＢａｍＨＩ识别位点）??反向序列?ｅｐｉ－Ｒ：?ＧＴＣＡＴＣＴＡＧＡＧＣＴＴＧＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＴＣＡＧＣ?（下划线碱??基为限制性内切酶Ｘｂａｌ识别位点）??３２??
【参考文献】：
期刊论文
[1]多杀菌素高产菌株的选育[J]. 贺玉平,戴经元,代鹏,胡西洲,林开春. 中国生物防治. 2006(01)
[2]多杀菌素生产菌株的选育[J]. 代鹏,徐雪莲,贺玉平,戴经元,林开春,黄俊生. 热带作物学报. 2005(04)
[3]多杀菌素的生物合成[J]. 苏建亚,沈晋良. 中国生物工程杂志. 2003(05)
硕士论文
[1]多杀菌素产生菌菌种选育及原生质体制备[D]. 程休.浙江大学 2006
本文编号：3097337
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