天目山土壤宏基因组文库构建与几丁质酶活性克隆筛选

发布时间：2021-05-09 02:07

　　微生物宏基因组（Metagenome）是指某一生境中所有微生物遗传物质的总和。土壤中存在大量资源微生物，但99%的微生物不能在实验室条件下培养，传统分离培养技术存在很大的弊端。宏基因组技术绕过培养的限制，为活性物质及功能基因的筛选提供了一条新的思路。本研究以浙江天目山土壤为材料，摸索土壤细菌宏基因组DNA的提取方法，构建了天目山土壤宏基因组文库并进行了功能基因的筛选，克隆得到了一个几丁质酶基因。详细结果如下：1.比较分析了不同土壤细菌DNA提取方法，通过优化得到了土壤细菌DNA提取的最佳方案，提取获得的DNA可以满足粘粒文库构建需求。通过比较分析分散后差速离心处理、分散后蔗糖梯度密度离心、琼脂糖凝胶包埋法、裂解法、透析袋法、冻融法等细菌细胞提取及DNA提取方法，总结出了土壤细菌DNA提取纯化的最佳方法：用0.2%焦磷酸钠溶液混匀土壤，在搅拌器中匀浆分散，匀浆后的土壤溶液600×g低速离心，所得上清10,000×g高速离心获得土壤细菌，采用CTAB碱裂解法，高温辅助裂解，低熔点琼脂糖凝胶与琼脂糖酶消化相结合回收土壤DNA。2.构建了基于粘粒的天目山土壤细菌宏基因组文库。将提取获得DNA进... 

【文章来源】：浙江农林大学浙江省

【文章页数】：73 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1 文献综述
        1.1 宏基因组文库
            1.1.1 宏基因组文库概念
            1.1.2 宏基因组文库的应用
            1.1.3 宏基因组文库技术
                1.1.3.1 土壤宏基因组文库构建
                1.1.3.2 文库分析筛选
            1.1.4 宏基因组文库在筛选生物活性物质方面的研究进展
        1.2 浙江天目山土壤微生物研究
            1.2.1 天目山独特的自然环境
            1.2.2 天目山土壤微生物研究进展
        1.3 几丁质酶
            1.3.1 几丁质酶概述
            1.3.2 几丁质酶在农业上的应用
            1.3.3 几丁质酶基因的筛选克隆
    2 本课题的研究目的和意义
    3 本课题的研究技术路线
第二章 天目山土壤宏基因组文库构建
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 土壤样品
            1.1.2 菌株、质粒
            1.1.3 主要试剂
            1.1.4 实验仪器
            1.1.5 土壤细菌洗涤液配制
            1.1.6 提取基因组 DNA 所需溶液
            1.1.7 文库构建所用溶液
        1.2 方法
            1.2.1 土壤细菌 DNA 提取与纯化
                1.2.1.1 土壤分散
                1.2.1.2 细菌提取
                1.2.1.3 土壤细菌洗涤
                1.2.1.4 提取土壤微生物总 DNA 方法比较
                1.2.1.5 DNA 质量检测
                1.2.1.6 土壤宏基因组纯化方法比较
                1.2.1.7 纯化后土壤宏基因组质量检测
            1.2.2 文库构建
                1.2.2.1 土壤细菌 DNA 片段酶切及筛选
                1.2.2.2 载体制备
                1.2.2.3 酶切基因组、粘粒载体质量检测
                1.2.2.4 连接
                1.2.2.5 包装
                1.2.2.6 滴度测定与转染
            1.2.3 文库保存
            1.2.4 文库质量检测
    2 结果与分析
        2.1 摸索了土壤细菌细胞、DNA 的提取及纯化条件，确定了土壤细菌宏基因组DNA 提取的最佳方法
        2.2 天目山土壤细菌宏基因组文库的构建
    3 小结
第三章 文库筛选与几丁质酶的基因克隆
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 供试菌株、质粒
            1.1.2 实验仪器设备
            1.1.3 实验所用培养基配制
        1.2 方法
            1.2.1 几丁质酶活性克隆筛选
            1.2.2 典型克隆拮抗病原真菌效果测定
            1.2.3 粘粒测序及几丁质酶基因分析
    2 结果与分析
        2.1 几丁质降解菌株的筛选
        2.2 几丁质降解菌株粘粒文库基因分析
    3 小结
第四章 结论与讨论
    1 结论与讨论
    2 下一步工作
参考文献
致谢
作者简介
附录



本文编号：3176405