玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63 srpA基因的功能分析

发布时间：2021-05-15 20:00

　　玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63是一株从马铃薯疮痂病自然衰退土壤中分离的生防菌，能够产生多种脂溶性抗生素，对多种植物病原真菌有抑制作用。A-因子及其类似物作为一种微生物激素广泛存在于多种链霉菌中，其上均含有一个γ-丁酸酯环结构。A-因子及其类似物对链霉菌的代谢和菌体形态分化具有重大调控作用，可调控链霉菌的气生菌丝生长、孢子形成以及次级代谢产物的形成。研究发现afsA基因家族能够编码链霉菌A-因子及其类似物合成过程中的一种关键酶。本实验室前期工作中将玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63抗生素合成基因簇定位于其线性质粒pSR47上，生物信息学分析发现pSR47含有afsA家族基因srpA。本研究通过基因敲除技术进行srpA基因的功能分析。主要研究结果如下：1)构建srpA基因敲除载体pKC1139-srpAF-tsr-srpAR，应用接合转移技术将pKC1139-srpAF-tsr-srpAR转入玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63，初筛获得硫链丝菌素抗性突变株。2)分别提取野生株和srpA突变株48h、60h、72h、84h菌丝体总RNA，进行逆转录PCR检测。发现不同时... 

【文章来源】：河北农业大学河北省

【文章页数】：50 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩写词表
1 引言
    1.1 玫瑰黄链霉菌研究进展
    1.2 A-因子及其类似物
    1.3 afsA 基因家族是 A-因子及其结构类似物生物合成途径中的关键基因
    1.4 基因功能研究方法—基因敲除与基因转导技术
    1.5 本研究的目的及意义
2 材料
    2.1 菌株和质粒
    2.2 PCR 引物
    2.3 限制性内切酶与试剂盒
    2.4 分子量标准
    2.5 抗生素
    2.6 培养基
    2.7 缓冲液及试剂
    2.8 常用仪器设备
3 方法
    3.1 玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 的菌种保存
    3.2 玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 孢子悬浮液的制备
    3.3 碱裂解法链霉菌质粒提取[67,79]
    3.4 srpA 基因的克隆及原核表达
        3.4.1 srpA 基因特异引物的设计
        3.4.2 srpA 的 PCR 扩增
        3.4.3 srpA 基因原核重组表达载体的构建[70,79,80]
        3.4.4 阳性克隆的筛选
        3.4.5 srpA 基因序列的测定与分析
        3.4.6 srpA 基因在 E. coli M15 中的诱导表达
        3.4.7 SrpA 蛋白检测
    3.5 玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 srpA 基因的敲除
        3.5.1 srpA 基因敲除载体的构建
        3.5.2 链霉菌-大肠杆菌之间的接合转移
        3.5.3 突变菌株的筛选验证
        3.5.4 srpA 基因功能分析
4 结果与分析
    4.1 srpA 基因的克隆及原核表达
        4.1.1 目的基因 srpA 的克隆
        4.1.2 srpA 基因的序列分析
        4.1.3 重组表达载体 pQE30-srpA 的构建
        4.1.4 srpA 基因在 E. coli 中的诱导表达与检测
    4.2 玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 srpA 基因的敲除
        4.2.1 srpAF、srpAR 的克隆
        4.2.2 tsr 基因克隆
        4.2.3 srpA 敲除载体 pKC1139-srpAF-tsr-srpAR 的验证
        4.2.4 野生型及突变株玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 中 srpA 转录分析
        4.2.5 srpA 缺失对链霉菌 Men-myco-93-63 液态培养条件下菌体生长的影响
        4.2.6 srpA 缺失对链霉菌 Men-myco-93-63 菌落形态的影响
        4.2.7 srpA 缺失对链霉菌 Men-myco-93-63 抗生素生产能力的影响
5 讨论
6 结论
7 参考文献
作者简历
致谢
在读期间发表的学术论文:


【参考文献】：
期刊论文
[1]自溶链霉菌遗传操作研究[J]. 杨本寿,尹敏,肖正群,徐丽华,姜成林,鲁涛.  云南大学学报(自然科学版). 2010(06)
[2]放线菌769抑菌谱及液体培养生长曲线的测定[J]. 张红丹,杜茜,张正坤,徐文静,陈光,李启云.  中国植保导刊. 2010(07)
[3]基因敲除与基因沉默[J]. 吕学诜,吕仁杰,吕超.  黑龙江医药科学. 2009(05)
[4]生防链霉菌Men-myco-93-63遗传转化体系的建立和优化[J]. 沈凤英,李亚宁,刘力强,吴伟刚,刘大群.  中国农学通报. 2009(13)
[5]高效检测分析玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63线性质粒[J]. 孙伟明,郭巍,刘大群.  微生物学报. 2008(12)
[6]人脂联素原核表达载体PQE30/ADPN的构建及在大肠杆菌中的表达[J]. 史晓文,刘德敏,孙颖,张捷.  天津医药. 2008(11)
[7]链霉菌细胞色素P450研究进展[J]. 李梅,曾凡荣.  微生物学通报. 2008(07)
[8]链霉菌看家基因引物的设计与验证[J]. 郭银平,黄英.  微生物学报. 2007(06)
[9]大肠杆菌原核表达载体pSBET-His的构建[J]. 陈正斌,谭仲夏,秦西云.  安徽农业科学. 2007(27)
[10]链霉菌质粒pSET152电转化稀有放线菌小单孢菌的研究[J]. 李晓华,龙慈凡,周秀芬,邓子新.  微生物学报. 2007(04)

硕士论文
[1]链霉菌分化负调节基因nsdA在抗生素高产育种上的应用[D]. 王茜.华中农业大学 2004



本文编号：3188247