核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）效应调控因子RRG-1和RRG-2的生物学功能研究

发布时间：2021-05-18 09:57

　　油菜菌核病是一种世界性病害,其病原为核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）。在我国,该病菌寄主范围非常广泛,能侵染包括75科278属400余种植物。目前,油菜菌核病的防治主要以化学防治为主。咯菌腈作为一种新型的苯吡咯类杀菌剂对油菜菌核病具有良好的防效,但该药剂在我国油菜菌核病的防治上尚未进行登记,同时,咯菌腈对核盘菌的作用机制尚不明确。本实验室已有研究表明,咯菌腈对核盘菌的作用机制与核盘菌的双组分信号系统有关,而RRG-1和RRG-2是双组分信号系统中两个重要的效应调控因子。因此,本文首先系统优化了核盘菌原生质体的制备与PEG介导的遗传转化体系；然后,利用该体系分别构建了基因敲除突变体及其回复突变体来研究RRG-1和RRG-2的生物学功能,进一步明确RRG-1和RRG-2对咯菌腈敏感性的调控机制。该研究将对油菜菌核病的综合防控、研发原创性杀菌剂具有重要意义。1.本文系统优化了核盘菌原生质体的制备条件及PEG介导的原生质体遗传转化体系。经优化,确定制备原生质体的最佳条件为：在25℃恒温震荡培养箱中用YEPD液体培养基175 r/min震荡培养出发菌株36 h；先用灭菌... 

【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：122 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号及缩略说明表
第一章 综述
    1 油菜菌核病及防治研究现状
        1.1 核盘菌概况
        1.2 核盘菌生活史
        1.3 油菜菌核病防治现状
            1.3.1 育种防治现状
            1.3.2 生物防治现状
            1.3.3 农业防治现状
            1.3.4 化学防治现状
    2 丝状真菌效应调控因子RRG-1、RRG-2的研究概况
        2.1 丝状真菌效应调控因子RRG-1
        2.2 丝状真菌效应调控因子RRG-2
    3 苯吡咯类杀菌剂研究概况
    4 本研究的目的和意义
    参考文献
第二章 核盘菌原生质体制备与遗传转化体系的优化
    摘要
    1 材料与方法
        1.1 菌株、质粒、培养基与试剂
        1.2 转化片段
        1.3 原生质体制备条件的优化
            1.3.1 菌丝培养条件的筛选
            1.3.2 菌丝培养时间的优化
            1.3.3 不同裂解酶组合的优化
            1.3.4 裂解酶浓度的优化
            1.3.5 酶解缓冲液的优化
            1.3.6 酶解时间的优化
            1.3.7 酶解温度的优化
            1.3.8 收集原生质体离心转速的优化
        1.4 再生培养条件的优化
            1.4.1 再生培养基(RM)的优化
            1.4.2 覆盖培养基(SRM)的优化
        1.5 PCR分析验证
    2 结果与分析
        2.1 原生质体制备条件的优化
            2.1.1 菌丝培养条件的筛选
            2.1.2 菌丝培养时间的优化
            2.1.3 不同酶组合的优化
            2.1.4 裂解酶浓度的优化
            2.1.5 酶解缓冲液的优化
            2.1.6 酶解时间的优化
            2.1.7 酶解温度的优化
            2.1.8 离心收集原生质体转速的优化
        2.2 再生培养条件的优化
            2.2.1 再生培养基(RM)的优化
            2.2.2 覆盖培养基(SRM)的优化
    3 讨论
    参考文献
    ABSTRACT
第三章 核盘菌效应调控因子SsRRG-1的生物学功能分析
    摘要
    1 材料和方法
        1.1 供试菌株、质粒、杀菌剂与培养基
        1.2 供试试剂
        1.3 核盘菌效应调控因子SsRRG-1的鉴定及序列分析
        1.4 核盘菌SsRRG-1基因敲除载体的构建
        1.5 原生质体的制备与遗传转化
            1.5.1 核盘菌原生质体的制备
            1.5.2 原生质体的转化
        1.6 转化子的验证
            1.6.1 潮霉素药剂验证
            1.6.2 PCR验证
            1.6.3 Southern杂交验证
        1.7 敲除突变体的互补验证
        1.8 表型分析
            1.8.1 对咯菌腈的敏感性测定
            1.8.2 菌丝生长速率测定、产菌核情况及菌丝显微形态观察
            1.8.3 对氧化压、渗透压、离子胁迫的敏感性测定
            1.8.4 对细胞壁抑制剂的敏感性测定
            1.8.5 菌丝电导率测定
            1.8.6 菌丝胞内甘油合成测定
            1.8.7 致病力测定
            1.8.8 侵染垫形成试验
            1.8.9 草酸合成测定
        1.9 SsRRG-1基因敲除对上下游基因表达的影响
            1.9.1 菌丝样品的制备
            1.9.2 样品RNA的提取
            1.9.3 荧光定量实时PCR
    2 结果与分析
        2.1 核盘菌SsRRG-1基因的鉴定及序列分析
        2.2 载体构建
        2.3 转化子验证
        2.4 敲除突变体表型分析
            2.4.1 对咯菌腈敏感性测定
            2.4.2 菌丝生长速率测定、产菌核情况及菌丝显微形态观察
            2.4.3 测定ΔSsRRG-1敲除突变体对渗透压、氧化压、离子胁迫的敏感性
        2.5 细胞膜透性测定
        2.6 胞内甘油含量测定
        2.7 细胞壁抑制剂敏感性测定
        2.8 致病力测定
        2.9 SsRRG-1基因敲除后对其上下游基因表达的影响
    3 讨论
    参考文献
    ABSTRACT
第四章 核盘菌效应调控因子SsRRG-2的基因功能分析
    摘要
    1 材料和方法
        1.1 供试菌株、质粒、杀菌剂与培养基
        1.2 供试试剂
        1.3 核盘菌RRG-2基因的鉴定及序列分析
        1.4 核盘菌RRG-2基因敲除载体的构建
        1.5 原生质体的制备与遗传转化
        1.6 转化子的验证
            1.6.1 潮霉素药剂验证
            1.6.2 PCR验证
            1.6.3 Southern杂交验证
        1.7 敲除突变体的互补验证
        1.8 表型分析
        1.9 SsRRG-2基因敲除对上下游基因表达的影响
    2 结果与分析
        2.1 核盘菌SsRRG-2基因的鉴定及序列分析
        2.2 核盘菌SsRRG-2基因敲除载体的构建
        2.3 转化子验证
        2.4 敲除突变体表型分析
            2.4.1 对杀菌剂敏感性测定
            2.4.2 菌丝生长速率测定、产菌核情况及菌丝显微形态观察
            2.4.3 测定ΔSsRRG-2敲除突变体对渗透压、氧化压、离子胁迫的敏感性
        2.5 细胞膜透性测定
        2.6 胞内甘油含量测定
        2.7 细胞膜、细胞壁抑制剂敏感性测定
        2.8 致病力
        2.9 SsRRG-2基因敲除后对其上下游基因表达的影响
    3 讨论
    参考文献
    ABSTRACT
全文小结
攻读硕士学位期间发表的学术论文及专利
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]核盘菌弱毒现象及其生防潜能的研究进展[J]. 聂峰杰,黄丽丽,康振生.  中国油料作物学报. 2013(03)
[2]白僵菌对几种常见植物病原菌的拮抗作用研究[J]. 夏龙荪,林华峰.  中国生物防治学报. 2013(02)
[3]油菜菌核病综合防治试验[J]. 王良吉,商鲁宁,周凡.  现代农业科技. 2011(19)
[4]几种药剂复配对油菜菌核病的防治效果比较[J]. 邓金花,张青,顾俊荣,周新伟,杨代凤.  江苏农业科学. 2011(03)
[5]新型杀菌剂氟咯菌腈及其研究开发进展[J]. 闫潇敏,宁斌科,王列平,张媛媛.  世界农药. 2010(03)
[6]核盘菌交配型基因mat1-1敲除载体的构建及转化[J]. 安乐,赵文生,张世宏,刘金亮,彭友良,潘洪玉.  吉林大学学报(理学版). 2010(01)
[7]植物病原真菌对二甲酰亚胺类杀菌剂的抗性分子机制[J]. 祝明亮,严金平,孙启玲,莫明和,张克勤.  生物技术. 2005(05)
[8]油菜菌核病抗药性监测与综合治理技术的研究[J]. 张夕林,孙雪梅,张谷丰,易红娟,羌烨.  农药科学与管理. 2003(06)
[9]几种核盘菌菌核重寄生真菌生物防治潜能的研究[J]. 马炳田,文成敬.  中国农学通报. 2002(06)

博士论文
[1]转录因子Ss-Nsd1和Ss-Fox1调控核盘菌有性及无性发育的功能研究[D]. 穆文辉.吉林大学 2013
[2]禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）对氰烯菌酯的抗药性机制研究[D]. 侯毅平.南京农业大学 2011
[3]油菜内生枯草芽孢杆菌BY-2的定殖生态、抗菌机制和防治菌核病的研究[D]. 江木兰.华中农业大学 2007

硕士论文
[1]盾壳霉ZS-1菌株对核盘菌弱毒株Ep-1PN影响的初步研究[D]. 唐清.华中农业大学 2009



本文编号：3193590