盐生草盐胁迫响应基因Unigene7547的克隆及在烟草中转化的初步研究

发布时间：2017-04-23 04:01

  本文关键词：盐生草盐胁迫响应基因Unigene7547的克隆及在烟草中转化的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：盐渍化是一种显著非生物胁迫,对我国资源环境产生了严重的影响。盐胁迫限制着植物的生长发育、蛋白质的合成、光合作用的进行及代谢活动等,影响其整个生命周期,是重要的非生物逆境因素。盐生植物因其具有丰富的抗盐碱基因库及在盐碱土地中生长良好而改善土地状况等特性,引起了当今科研人员的高度重视。盐生草(Halogeton glomeratus)为藜科盐生草属一年生盐生植物,在我国主要分布在西北大部分省份、内蒙古、东北以西地区等。其具有适应干旱、盐碱、高温等严酷环境的特点,地上多分枝的茎和叶的肉质化程度较高,具有较强的保持水土、防风固沙、耐盐和抗旱的能力。盐生草是获取耐盐基因的优良野生资源,在盐渍荒漠地区改良土壤和环境问题等方面起着决定性的作用。本研究的主要内容与实验结果如下:1.基于盐生草转录组测序结果,筛选出表达上调较高的基因Unigene7547并设计引物,在盐生草中成功克隆Unigene7547基因全序列。该序列全长为1306 bp,包含1218bp的ORF,编码405个氨基酸,分子量为45.16 kDa。蛋白呈酸性,属于不稳定蛋白质。2.Unigene7547基因编码蛋白定位于细胞核内可信度高达0.600,线粒体基质内可信度达0.100,溶酶体内可信度达0.100,微体内可信度达0.018。该蛋白为亲水性蛋白,无跨膜区域。不存在信号肽,为非分泌型蛋白。预测该蛋白在细胞核内表达。我们发现Unigene7547中Thr、Ser、Tyr分别含有8、8、5个磷酸化位点,可能影响细胞生理活动和修饰调控等方面功能。二级结构中随机卷曲、延伸链、α螺旋、β-转角分别为37.78%、28.89%、23.46%、9.88%。进行BLAST同源性比对后,没有发现与Unigene7547基因cDNA全序列匹配的序列且该基因为首次发现,因此推测其为新基因。综合以上分析表明,仅对盐生草Unigene7547基因编码蛋白的生物性状进行了浅层次的研究,为后续实验的开展提供了理论依据,但相关特殊功能有待进一步研究。3.采用常规分子克隆技术,设计含有XbaⅠ和SmaⅠ酶切位点的特异性引物,用其对Unigene7547基因和植物表达载体pBI121质粒进行双酶切,再用T4 DNA Ligase连接,构建了植物表达载体pBI-Unigene7547。将pBI-Unigene7547导入农杆菌中,并介导烟草叶片,得到抗性植株。经PCR扩增后电泳检测结果表明,可初步判定Unigene7547基因已成功转入烟草,这一结果为该基因相关功能的验证提供了帮助,也为其在提升栽培作物抗盐性等方面做好了准备。
【关键词】：盐生草 Unigene7547基因 植物表达载体 转基因烟草
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;S156.4
【目录】：

• 摘要2-3
• Summary3-9
• 缩略词表9-10
• 第一章 文献综述10-19
• 1.1 土壤盐碱化的现状与危害10
• 1.2 盐胁迫对植物的影响10-14
• 1.2.1 盐胁迫对植物生长发育的影响10-11
• 1.2.2 盐胁迫对植物的生理伤害11-12
• 1.2.2.1 盐胁迫下的渗透胁迫11
• 1.2.2.2 盐胁迫下的离子毒害11-12
• 1.2.2.3 盐胁迫下氧化胁迫对植物的影响12
• 1.2.3 盐胁迫对植物激素的影响12-13
• 1.2.4 盐胁迫对植物光合作用的影响变化13-14
• 1.3 植物的耐盐机制14-16
• 1.3.1 盐胁迫种子萌发的机理14
• 1.3.2 盐胁迫下渗透调节物质的作用14-15
• 1.3.3 植物体内离子选择性吸收和区隔化15
• 1.3.4 盐生植物与非盐生植物耐盐机制差异15-16
• 1.4 植物耐盐相关基因的研究进展16-17
• 1.4.1 离子转运相关基因16
• 1.4.2 渗透调节相关基因16
• 1.4.3 盐胁迫信号传导基因及表达调节相关功能基因16
• 1.4.4 与细胞排毒、抗氧化性相关的酶基因16-17
• 1.4.5 保护细胞免受胁迫伤害的相关功能蛋白基因17
• 1.5 研究目的和意义17-18
• 1.6 技术路线18-19
• 第二章 盐生草Unigene7547基因的克隆及序列分析19-35
• 2.1 试验材料与试剂19-20
• 2.1.1 试验材料19
• 2.1.2 试剂及常用酶19
• 2.1.3 引物设计19
• 2.1.4 培养基19-20
• 2.1.5 菌株与克隆载体20
• 2.1.6 仪器与设备20
• 2.2 试验方法20-26
• 2.2.1 盐生草总RNA的提取20-21
• 2.2.2 cDNA第一链的合成21
• 2.2.3 盐生草Unigene7547基因的克隆21-24
• 2.2.3.1 盐生草Unigene7547基因核心片段的克隆21-22
• 2.2.3.2 盐生草Unigene7547基因 3' Racer的克隆22
• 2.2.3.3 盐生草Unigene7547基因 5' Racer的克隆22-24
• 2.2.4 基因的测序及全长序列的拼接24-25
• 2.2.4.1 PCR产物回收纯化24-25
• 2.2.4.2 连接克隆载体25
• 2.2.4.3 连接产物转化大肠杆菌DH5α25
• 2.2.4.4 蓝白斑的筛选及测序25
• 2.2.4.5 基因全长拼接25
• 2.2.5 目的基因的生物信息学分析25-26
• 2.3 结果与分析26-33
• 2.3.1 总RNA的提取26
• 2.3.2 盐生草Unigene7547基因的克隆及序列拼接26-29
• 2.3.3 Unigene7547基因的生物信息学分析29-33
• 2.3.3.1 Unigene7547基因编码蛋白理化性质预测29
• 2.3.3.2 Unigene7547基因编码蛋白亚细胞定位29-30
• 2.3.3.3 Unigene7547基因编码蛋白的跨膜区和疏水性分析30-31
• 2.3.3.4 Unigene7547基因编码蛋白信号肽预测31-32
• 2.3.3.5 Unigene7547基因编码蛋白的磷酸化位点预测32
• 2.3.3.6 Unigene7547基因编码蛋白的二级结构预测32-33
• 2.4 讨论33-35
• 2.4.1 盐生草Unigene7547基因的克隆33
• 2.4.2 盐生草Unigene7547基因的生物信息学分析33-35
• 第三章 盐生草Unigene7547基因表达载体构建与遗传转化35-50
• 3.1 试验材料和试剂35
• 3.1.1 试剂与工具酶35
• 3.1.2 培养基35
• 3.1.3 植物表达载体和菌株35
• 3.2 试验方法35-41
• 3.2.1 引物设计35
• 3.2.2 克隆目的基因35-36
• 3.2.2.1 目的片段的扩增35-36
• 3.2.2.2 回收纯化目的片段36
• 3.2.2.3 回收产物加A尾36
• 3.2.3 回收产物连接克隆载体36-37
• 3.2.4 连接产物转化大肠杆菌DH5α37
• 3.2.5 阳性重组子的筛选与测序37
• 3.2.6 重组质粒的鉴定37-38
• 3.2.6.1 重组质粒的小量提取37-38
• 3.2.6.2 重组质粒的PCR鉴定38
• 3.2.7 构建植物表达载体pBI-Unigene754738-39
• 3.2.7.1 质粒的双酶切38-39
• 3.2.7.2 目的片段与载体pBI121连接39
• 3.2.7.3 连接产物转化大肠杆菌DH5α39
• 3.2.7.4 蓝白斑的筛选与测序39
• 3.2.7.5 重组质粒的PCR鉴定和双酶切鉴定39
• 3.2.8 pBI-Unigene7547转化农杆菌39-40
• 3.2.8.1 农杆菌感受态细胞LBA4404的制备39-40
• 3.2.8.2 将重组质粒pBI-Unigene7547转入农杆菌40
• 3.2.8.3 阳性克隆的筛选及抗性菌落PCR检测40
• 3.2.9 农杆菌介导的烟草转化40-41
• 3.2.9.1 烟草叶片组织培养40
• 3.2.9.2 农杆菌的活化与制备40-41
• 3.2.9.3 农杆菌浸染烟草叶片41
• 3.2.9.4 转基因烟草的检测41
• 3.3 结果与分析41-48
• 3.3.1 克隆目的基因41-45
• 3.3.2 构建植物表达载体45-46
• 3.3.2.1 植物表达载体pBI- Unigene7547的构建45
• 3.3.2.2 植物表达载体pBI- Unigene7547的鉴定45-46
• 3.3.3 农杆菌介导的烟草转化46-48
• 3.3.3.1 重组质粒pBI-Unigene7547的农杆菌转化46-47
• 3.3.3.2 农杆菌浸染烟草叶片组织47-48
• 3.3.3.3 转基因烟草的检测48
• 3.4 讨论48-50
• 结论50-51
• 参考文献51-58
• 致谢58-59
• 作者简介59-60
• 导师简介60-61

【参考文献】

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本文编号：321761