暗黑鳃金龟幼虫对Bt蛋白的反应及类钙粘蛋白的克隆与表达分析

发布时间：2021-06-08 07:43

　　暗黑鳃金龟Holotrichia parallela Motschulsky是公认的难以防治的农林重要害虫,其幼虫严重为害花生、大豆、马铃薯、小麦等农作物。苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis（简称Bt）是目前世界上应用范围最广的微生物杀虫剂。研究表明,Bt产生的伴孢晶体含有杀虫晶体蛋白,能有效地防治鳞翅目、鞘翅目、双翅目等200多种害虫及动植物线虫。类钙粘蛋白是一类依赖钙离子的跨膜糖蛋白,在细胞识别、细胞信号转导及维持细胞形态结构等方面发挥着重要的作用,而且是Bt最重要的受体蛋白。目前,关于这些方面的研究主要集中在鳞翅目昆虫,对于鞘翅目昆虫的研究很少,尤其是地下害虫更是少之又少。本研究以暗黑鳃金龟幼虫为供试对象,通过转录组测序、RACE以及实时荧光定量PCR等技术,在研究暗黑鳃金龟幼虫对Bt蛋白毒力反应的基础上,进一步对其类钙粘蛋白基因进行了克隆和表达量分析,主要研究结果如下:1、建立琼脂糖凝胶颗粒生测体系,在25℃下,用不同浓度的3种Bt蛋白饲喂暗黑鳃金龟5日龄幼虫,14天后调查幼虫死亡情况,结果表明3种Bt蛋白对暗黑鳃金龟幼虫均有一定的杀虫活性。Cry8E、... 

【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1.文献综述
    1.1 暗黑鳃金龟的习性
    1.2 发生与危害
    1.3 暗黑鳃金龟的综合防治
        1.3.1 化学防治
        1.3.2 物理防治
        1.3.3 农业防治
        1.3.4 生物防治
            1.3.4.1 真菌类
            1.3.4.2 苏云金芽孢杆菌
            1.3.4.3 昆虫病原线虫
            1.3.4.4 天敌昆虫
            1.3.4.5 其他防治
    1.4 类钙粘蛋白
        1.4.1 类钙粘蛋白的种类和特征
        1.4.2 类钙粘蛋白作用机制及研究进展
    1.5 本研究的目的与意义
    1.6 研究内容及技术路线
        1.6.1 研究的主要内容
        1.6.2 技术路线
2.试验材料与方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 供试虫源
        2.1.2 供试菌株
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 主要试剂
        2.1.5 溶液和培养基配制
    2.2 试验方法
        2.2.1 三种Bt蛋白对暗黑鳃金龟致死率的影响
            2.2.1.1 Bt孢晶悬液制备
            2.2.1.2 Bt芽孢镜检
            2.2.1.3 Bt蛋白的提取
            2.2.1.4 SDS-PAGE电泳检测
            2.2.1.5 三种Bt蛋白浓度的测定（Bradford法）
            2.2.1.6 三种Bt蛋白对暗黑鳃金龟5日龄幼虫存活率的影响
            2.2.1.7 数据处理
        2.2.2 暗黑鳃金龟3龄幼虫中肠的转录组测序
            2.2.2.1 中肠总RNA的提取
            2.2.2.2 转录组测序
            2.2.2.3 转录组数据分析
        2.2.3 11种拟Bt受体蛋白片段的扩增
            2.2.3.1 总RNA的提取
            2.2.3.2 反转录合成第一链cDNA
            2.2.3.3 利用特异性引物扩增Bt受体蛋白片段
            2.2.3.4 PCR产物回收
            2.2.3.5 PCR回收产物连接至T载体
            2.2.3.6 重组质粒的转化
            2.2.3.7 阳性克隆验证
        2.2.4 类钙粘蛋白全长cDNA的克隆
            2.2.4.1 总RNA的提取
            2.2.4.2 反转录合成第一链cDNA
            2.2.4.3 PCR扩增部分序列
            2.2.4.4 RACE引物设计
            2.2.4.5 cDNA3’末端扩增—3’ RACE
            2.2.4.6 cDNA 5’末端扩增—5’ RACE
            2.2.4.7 质粒提取
            2.2.4.9 序列分析
        2.2.5 类钙粘蛋白相对表达量的分析
            2.2.5.1 类钙粘蛋白、内参基因定量引物设计及片段的扩增
            2.2.5.2 荧光定量PCR反应
            2.2.5.3 数据处理
3.结果与分析
    3.1 Bt蛋白对暗黑鳃金龟5日龄幼虫存活率的影响
        3.1.1 Bt蛋白的提取
        3.1.2 三种Bt蛋白浓度的测定
        3.1.3 三种Bt蛋白对暗黑鳃金龟幼虫致死率的影响
    3.2 暗黑鳃金龟幼虫中肠转录组测序
        3.2.1 暗黑鳃金龟幼虫中肠总RNA的提取
        3.2.2 暗黑鳃金龟3龄幼虫中肠转录组分析
            3.2.2.1 暗黑鳃金龟3龄幼虫中肠Unigene亲缘性分析
            3.2.2.2 暗黑鳃金龟幼虫中肠Unigene的KOG分析
            3.2.2.3 暗黑鳃金龟幼虫中肠Unigene的GO分析
            3.2.2.4 暗黑鳃金龟幼虫中肠APN和类钙粘蛋白进化树的建立
    3.3 11种拟Bt受体蛋白片段的克隆
    3.4 类钙粘蛋白全长cDNA的克隆
        3.4.1 类钙粘蛋白cDNA片段扩增
        3.4.2 类钙粘蛋白cDNA全长扩增
        3.4.3 暗黑鳃金龟幼虫类钙粘蛋白基因序列分析
        3.4.4 暗黑鳃金龟幼虫类钙粘蛋白同源性分析
    3.5 类钙粘蛋白基因表达量分析
        3.5.1 引物特异性检测
        3.5.2 不同龄期类钙粘蛋白相对表达量分析
        3.5.3 3龄幼虫不同组织类钙粘蛋白相对表达量分析
4.结论
5.讨论
参考文献
附录 1
附录 2
致谢
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]青岛地区暗黑鳃金龟性信息素鉴定及田间应用技术[J]. 鞠倩,李晓,姜晓静,赵志强,蒋相国,倪皖莉,曲明静.  植物保护学报. 2014(02)
[2]夏大豆田暗黑鳃金龟发生危害规律研究[J]. 史树森,崔娟,宋鹏翔,臧冬初,李维宇,武婷婷.  大豆科学. 2014(01)
[3]钙粘蛋白与苏云金芽胞杆菌晶体毒素互作机制研究进展[J]. 赵新民,周攀登,刘淑云,徐玲,夏莉,夏立秋,孙运军.  微生物学通报. 2013(04)
[4]绿僵菌防治蛴螬的应用研究进展[J]. 于永浩,龙秀珍,曾宪儒,韦德卫,曾涛.  南方农业学报. 2013(01)
[5]60%吡虫啉悬浮种衣剂防治花生田蛴螬试验初报[J]. 周长勇,汪立新,周平.  安徽农学通报(下半月刊). 2012(20)
[6]吡虫啉悬浮种衣剂对花生蛴螬防治效果的研究[J]. 谢吉先,王书勤,陈志德.  农业科技通讯. 2012(06)
[7]金龟子绿僵菌CQMa128新制剂对花生蛴螬的田间防控效果[J]. 殷幼平,申剑飞,时玉娟,刘美昌,邵长文,王中康.  植物保护. 2012(03)
[8]浅谈蛴螬对草坪的危害[J]. 张震,赵晔.  现代园艺. 2012(06)
[9]苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白研究综述[J]. 黎娅.  武汉生物工程学院学报. 2012(01)
[10]杭州地区蓝莓上金龟子的发生与防治[J]. 李明江,黄俊,沈福泉,陈常理,朱开元,周新生.  现代农业科技. 2011(16)

博士论文
[1]对金龟甲科、叶甲科害虫高毒力苏云金芽胞杆菌杀虫基因及工程菌的研究[D]. 闫贵欣.中国农业科学院 2009

硕士论文
[1]二化螟中肠类钙粘蛋白基因的功能分析[D]. 杜立啸.中国农业科学院 2014
[2]Cry8Ga1和Cry8Ea1蛋白毒杀蛴螬的生理生化机制研究[D]. 谭树乾.西北农林科技大学 2013
[3]蛴螬高致病力绿僵菌菌株的鉴定筛选与新制剂的田间应用技术研究[D]. 申剑飞.重庆大学 2011
[4]昆虫病原线虫的筛选鉴定及其对蛴螬的致病性研究[D]. 刘树森.中国农业科学院 2009
[5]对鞘翅目害虫有活性Bt菌株的筛选及cry8Ea2基因的克隆、表达和活性研究[D]. 刘兴龙.河北农业大学 2008
[6]金龟子绿僵菌的生物学及其在花生蛴螬防治中的应用[D]. 王萍莉.安徽农业大学 2006



本文编号：3217979