基于核酸DNA/RNA同位素示踪技术的水稻土甲烷氧化微生物研究
发布时间：2021-07-09 07:30
稳定性同位素示踪复杂土壤中微生物DNA/RNA的技术难点是13C-DNA/RNA的鉴定。本研究针对我国六种典型水稻土,利用稳定性同位素13CH4示踪活性的甲烷氧化菌,超高速密度梯度离心获得不同浮力密度DNA/RNA后,以甲烷氧化菌独有的pmo A功能基因和16S r RNA特异基因作为分子标靶,通过半定量凝胶电泳技术评价了特异基因作为分子标靶判定13C-DNA/RNA的可行性,进一步利用克隆文库技术研究水稻土中的活性甲烷氧化菌群落结构。结果表明:甲烷氧化菌功能基因pmo A作为分子标靶,能够准确鉴别13C-DNA,而甲烷氧化菌特异的16S r RNA基因则能较好地区分12C和13C标记的RNA,但13C-RNA中的非目标微生物污染高于13C-DNA示踪技术。进一步以13C-DNA和13C-RNA为模板,分别构建了pmo A和16S r RNA基因的克隆文库,系统发育分析表明I型菌主导了土壤甲烷氧化过程,其中江西鹰潭和黑龙江五常土壤中活性甲烷氧化菌全部属于Ia型,而四川资阳、浙江嘉兴、江苏常熟和江都土壤中Ia型和Ib型甲烷氧化菌均有发现,并且后者比例较低。这些结果表明分子标靶基因能够有效...
【文章来源】：土壤学报. 2016,53(02)北大核心CSCD
【文章页数】：12 页
【部分图文】：
六种典型水稻土的好氧甲烷氧化过程
http：//pedologica.issas.ac.cn494土壤学报53卷（浙江嘉兴）、69.2%（四川资阳）、58.3%（江苏常熟）、56.0%（黑龙江五常）、44.0%（江苏江都）。这些结果表明：除江苏江都水稻土外，Methylocystis（II型）是典型水稻土中的优势甲烷氧化菌。值得注意的是，所有土壤中均未检测到另一大类Ⅱ型甲烷氧化菌Methylosinus（图2）。2.3水稻土中甲烷氧化菌13C-DNA/RNA鉴别超高速密度梯度离心获得不同浮力密度DNA后，通过聚合酶链式反应PCR扩增甲烷氧化菌的特异功能基因pmoA，并利用琼脂糖凝胶电泳开展半定量分析（图3a）。在重浮力密度DNA中（5～7层），13C-甲烷标记处理样品中发现了大量pmoA基因信号，而在相同的位置（5～7层）中，12C-甲烷对照处理样品未检测到明显的pmoA信号（图3a）。相反，在超高速密度梯度离心试管的上部（9～11层），12C-甲烷处理的不同浮力密度DNA中发现了大量的pmoA基因扩增产物。这些结果表明：13C-甲烷标记处理土壤中的甲烷氧化菌快速生长并同化了大量的13C合成核酸DNA，在超高速密度梯度离心过程中，这些甲烷氧化菌的13C-DNA与未标记的土壤总DNA分离并迁移聚集在试管下部的重浮力密度离心液中（5～7层）。类似于DNA分析，针对13C-甲烷标记处理和12C-甲烷对照处理的不同浮力密度的RNA，利用好氧甲烷氧化菌16SrRNA引物进行一步法反转录扩增（OnestepRNAPCRkit）并进行半定量凝胶电泳分析。结果表明（图3b），13C-标记处理的重浮力密度（5～7层）RNA中好氧甲烷氧化菌16SrRNA信号明显强于12C-对照处理，说明好氧甲烷氧化菌利用13CH4合成大量的核糖体13C-RNA。在超高速密度梯度离心过程中，这些标记的核酸分子随着浮力密度增加迁移至试管下部。然?
http：//pedologica.issas.ac.cn2期郑燕等：基于核酸DNA/RNA同位素示踪技术的水稻土甲烷氧化微生物研究495图3好氧甲烷氧化菌功能基因pmoA扩增产物（a）以及好氧甲烷氧化菌16SrRNA反转录扩增产物（b）分别在不同浮力密度DNA和RNA中的分布规律Fig.3AgarosegelelectrophoresisofpmoAgeneamplicons（a）andmethanotrophic16SrRNAreversetranscriptionamplicons（b）fromtheultracentrifugedDNAandRNAovertheentiredensityrangeofSIP，respectively表213CH4标记和12CH4对照处理重浮力密度RNA中好氧甲烷氧化菌16SrRNA序列比例变化1）Table2Thepercentagechangesofmethanotrophic16SrRNAsequencesinthe‘heavy’RNAfractionsfromthemicrocosmsincubatedwith13CH4and12CH4样品Sample浮力密度重层Heavyfractions16SrRNA克隆数Thenumbersof16SrRNAclones好氧甲烷氧化菌占总细菌的比例TherelativeabundanceofMOB（%）13CH412CH413CH412CH4YT51080.0%6121075.0%10.0%71040.0%ZY5887.5%61210100.0%20.0%7683.3%JX51060.0%6101080.0%20.0%71181.8%CS6201950.0%0.0%JD51180.0%69980.0%11.1%7580.0%WC5977.8%69766.7%14.3%71060.0%1）数据来源于16SrRNA序列系统发育分析Thedatawasbasedonthephylogeneticrelationshipof16SrRNAsequences
【参考文献】：
期刊论文
[1]新一代高通量测序与稳定性同位素示踪DNA/RNA技术研究稻田红壤甲烷氧化的微生物过程[J]. 郑燕,贾仲君. 微生物学报. 2013(02)
[2]稳定性同位素核酸探针技术DNA-SIP原理与应用[J]. 贾仲君. 微生物学报. 2011(12)
[3]水稻田土壤甲烷氧化活性及其环境影响因子的研究[J]. 闵航,陈中云,陈美慈. 土壤学报. 2002(05)
本文编号：3273315
【文章来源】：土壤学报. 2016,53(02)北大核心CSCD
【文章页数】：12 页
【部分图文】：
六种典型水稻土的好氧甲烷氧化过程
http：//pedologica.issas.ac.cn494土壤学报53卷（浙江嘉兴）、69.2%（四川资阳）、58.3%（江苏常熟）、56.0%（黑龙江五常）、44.0%（江苏江都）。这些结果表明：除江苏江都水稻土外，Methylocystis（II型）是典型水稻土中的优势甲烷氧化菌。值得注意的是，所有土壤中均未检测到另一大类Ⅱ型甲烷氧化菌Methylosinus（图2）。2.3水稻土中甲烷氧化菌13C-DNA/RNA鉴别超高速密度梯度离心获得不同浮力密度DNA后，通过聚合酶链式反应PCR扩增甲烷氧化菌的特异功能基因pmoA，并利用琼脂糖凝胶电泳开展半定量分析（图3a）。在重浮力密度DNA中（5～7层），13C-甲烷标记处理样品中发现了大量pmoA基因信号，而在相同的位置（5～7层）中，12C-甲烷对照处理样品未检测到明显的pmoA信号（图3a）。相反，在超高速密度梯度离心试管的上部（9～11层），12C-甲烷处理的不同浮力密度DNA中发现了大量的pmoA基因扩增产物。这些结果表明：13C-甲烷标记处理土壤中的甲烷氧化菌快速生长并同化了大量的13C合成核酸DNA，在超高速密度梯度离心过程中，这些甲烷氧化菌的13C-DNA与未标记的土壤总DNA分离并迁移聚集在试管下部的重浮力密度离心液中（5～7层）。类似于DNA分析，针对13C-甲烷标记处理和12C-甲烷对照处理的不同浮力密度的RNA，利用好氧甲烷氧化菌16SrRNA引物进行一步法反转录扩增（OnestepRNAPCRkit）并进行半定量凝胶电泳分析。结果表明（图3b），13C-标记处理的重浮力密度（5～7层）RNA中好氧甲烷氧化菌16SrRNA信号明显强于12C-对照处理，说明好氧甲烷氧化菌利用13CH4合成大量的核糖体13C-RNA。在超高速密度梯度离心过程中，这些标记的核酸分子随着浮力密度增加迁移至试管下部。然?
http：//pedologica.issas.ac.cn2期郑燕等：基于核酸DNA/RNA同位素示踪技术的水稻土甲烷氧化微生物研究495图3好氧甲烷氧化菌功能基因pmoA扩增产物（a）以及好氧甲烷氧化菌16SrRNA反转录扩增产物（b）分别在不同浮力密度DNA和RNA中的分布规律Fig.3AgarosegelelectrophoresisofpmoAgeneamplicons（a）andmethanotrophic16SrRNAreversetranscriptionamplicons（b）fromtheultracentrifugedDNAandRNAovertheentiredensityrangeofSIP，respectively表213CH4标记和12CH4对照处理重浮力密度RNA中好氧甲烷氧化菌16SrRNA序列比例变化1）Table2Thepercentagechangesofmethanotrophic16SrRNAsequencesinthe‘heavy’RNAfractionsfromthemicrocosmsincubatedwith13CH4and12CH4样品Sample浮力密度重层Heavyfractions16SrRNA克隆数Thenumbersof16SrRNAclones好氧甲烷氧化菌占总细菌的比例TherelativeabundanceofMOB（%）13CH412CH413CH412CH4YT51080.0%6121075.0%10.0%71040.0%ZY5887.5%61210100.0%20.0%7683.3%JX51060.0%6101080.0%20.0%71181.8%CS6201950.0%0.0%JD51180.0%69980.0%11.1%7580.0%WC5977.8%69766.7%14.3%71060.0%1）数据来源于16SrRNA序列系统发育分析Thedatawasbasedonthephylogeneticrelationshipof16SrRNAsequences
【参考文献】：
期刊论文
[1]新一代高通量测序与稳定性同位素示踪DNA/RNA技术研究稻田红壤甲烷氧化的微生物过程[J]. 郑燕,贾仲君. 微生物学报. 2013(02)
[2]稳定性同位素核酸探针技术DNA-SIP原理与应用[J]. 贾仲君. 微生物学报. 2011(12)
[3]水稻田土壤甲烷氧化活性及其环境影响因子的研究[J]. 闵航,陈中云,陈美慈. 土壤学报. 2002(05)
本文编号：3273315
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