运用Padlock探针和LAMP技术检测瓜类细菌性角斑病菌
发布时间：2021-07-10 18:30
丁香假单胞菌黄瓜致病变种（Pseudomonas syringae pv. lachrymans）引起的黄瓜细菌性角斑病在世界范围内皆有发生,造成不同程度的损失,同时也引起甜瓜细菌性叶斑病,是一种种传病害。近年来在中国逐渐发展严重,危害严重时会造成严重减产。所以建立高效,快捷,操作简单的检测技术是防止此病原菌传播的有效手段。瓜类细菌性果斑病（bacterial fruit blotch）的病原菌为西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli）,是一种危害西瓜和甜瓜的世界检疫性种传病害。丁香假单胞黄瓜致病变种和西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli）和在甜瓜上的发病症状很相似,我们很难用肉眼和传统的检验检疫方法将两者区分。本研究运用Padlock探针和LAMP两种检测方法,设计了针对丁香假单胞菌黄瓜致病变种甜瓜株系的特异性探针和LAMP,针对黄瓜株系的特异性探针和LAMP。同时进行了特异性验证,灵敏度验证,模拟种子带菌检测和实际样品检测。并将探针与Macroarray技术结合进行了病原菌的高通量检测。实验结果表明：这2条探针和2套LAMP均能把所有的参试菌株的这两个株系...
【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１下香假单胞黄瓜致病变种为害黄瓜和甜瓜图（张吉光等，２０１０）??Ｆｉｇ．?１．?Ｃｕｃｕｍｂｅｒ?ａｎｄ?ｍｅｌｏｎ?ｉｎｆｅｃｔｅｄ?从如所０口幻５?巧ｒ／巧各口ｅ?Ｐ乂?／幻幻７ＴＳ??
巧光定量ＰＣＲ拥有ＴａｑＭａｎ探针检测和ＳＹＢＲ?Ｇｒｅｅｎ?Ｉ检测两种检测模式。有５＇—３’外切核酸酶活性的Ｔａｑ酶是ＴａｑＭａｎ探针的扩增原理，并将巧光标记加入反应体系中。常规ＴａｑＭａｎ探针在ＰＣＲ过程中不能被延伸，５＇端发射基光发射被３＇端巧灭基团抑制。ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ?Ｉ染料特异性很强只与双链ＤＮＡ小，发出芙光。当它从双链上释放出来时，巧光信号减弱，所Ｗ双链ＤＮＡ分子能通过巧光信号的强弱来进行判断。这项技术也存在一定的缺点，它能与非恃双链ＤＮＡ结合造成假阳性结果（欧阳松应等，２００４）??．７?Ｐａｄｌｏｃｋ?探针??Ｐａｄｌｏｃｋ探针是一条长的寡聚核昔酸链，长度为ｌ（Ｍ３ｂｐ左右，探针两端（憐酸化和経基化的３端）能与目的片段进行特异性的结合。探针两端称为Ｔ１端和Ｔ２端，两端有很强的特异性，只有与目标片段完全匹配时，其在连接酶的作用下，探与祀标片段互补形成环状。为了使这项技术用于病原菌的诊断，Ｍａｒｉａｎｎａ?Ｓｚｅ人对如何保证高特异性和在实际检测中没有目的祀标的情况下如何消除自身应进行了优化。将Ｔ１端和Ｔ２端设计成不对称的两端，并且Ｔ２端（３端）明思短（５端）（Ｍａｒｉａｎｎａ?Ｓｚｅｍｅｓ等?２００５）。??Ｐａｄｌｏｃｋ?ｐｒｏｂｅ??
图３?ＬＡＭ巧Ｉ物合成图（Ｊｕｎ化２００９）??Ｆｉｇ３．?Ｐｒｉｍｅｒ?ｆｏｒ?ＬＡＭＰ??ＡＭＰ的反应机制可Ｗ分为Ｈ个部分。初始阶段为合成哑铃形结构阶段、循环Ｗ及再循环阶段，最后会产生大小不一的花挪菜状茎－环ＤＮＡ。ＬＡＭＰ采用的换活性，引物由两个内引物（ＦＩＰ，ＢＩＰ）及两个外引物（Ｆ３，?Ｂ３）构成，其视标ＤＮＡ上的６个特异性位点。只有当餓标上这６个特异位点彼四条引物完全，才能进行扩增（Ｙａｓｕｙｏｓｈｉ?Ｍｏｒｉ，?２００９）。??作为一种新型的高特异性和快速的检测方法，环介导等温扩增（ｌａｍｐ）已经用于各种领域。在最初的发展阶段，ＬＡＭＰ运用于检测食品上的一些病原菌，??沙口氏菌，李斯特菌，志贺菌属，大肠杆菌，弯曲杆菌的ｌａｍｐ试剂盒已经商ＡＭＰ也被广泛运用于动物疫病检测中。Ｉｗａｍｏｔｏ创建了分支杆菌属的检测体系，海创建了日蹄疫病毒的ＲＴ－ＬＡＭＰ检测方法，Ｚｈａｎｇ等同样运用ＲＴ－ＬＡＭＰ方法猪癌病毒的检测体系（杨德全等，２０１１）。ＬＡＭＰ在植物病原菌的检测中发挥极用。化ｍｌｉｎｓｏｎ等将艮ｅａｌｔｉｍｅＰＣ民与ＬＡＭＰ想结合，建立Ｒｅａｌｔｉｍｅ－ＬＡＭＰ检测体速用于灰霉病菌的检测。Ｎｉｅｓｓｅｎ等运用ＬＡＭＰ技术能在３０ｍｉｎ成功的从大麦种
【参考文献】：
期刊论文
[1]黄瓜棒孢叶斑病菌PCR检测方法的建立[J]. 陈璐,石延霞,谢学文,柴阿丽,李宝聚. 园艺学报. 2014(03)
[2]黄瓜细菌性角斑病的分子检测[J]. 王平,樊金娟,刘长远,赵奎华,梁春浩. 中国农学通报. 2012(25)
[3]环介导等温扩增法检测转基因玉米MON89034[J]. 张隽,李志勇,叶宇鑫,黄韵,刘津,余以刚,高东微,石磊. 现代食品科技. 2012(04)
[4]应用PCR方法快速检测黄瓜细菌性角斑病菌[J]. 王哲,陈青,田茜,李志红,朱水芳,赵文军. 植物检疫. 2011(06)
[5]黄瓜细菌性角斑病发病症状及综合防治技术[J]. 史云国. 上海蔬菜. 2011(03)
[6]瓜类细菌性果斑病研究进展[J]. 阎莎莎,王铁霖,赵廷昌. 植物检疫. 2011(03)
[7]黄瓜细菌性角斑病菌的分离与鉴定[J]. 张吉光,陈璐,张管曲,胡小平,王保通. 西北农业学报. 2010(12)
[8]免疫吸附PCR技术提高梨火疫病菌检测灵敏度[J]. 苏梅华,吴建波,李秋英,卢玲,胡白石. 植物检疫. 2010(03)
[9]环介导等温扩增（LAMP）技术的应用研究[J]. 刘永生,丁耀忠,张杰. 中国农学通报. 2010(08)
[10]抗草甘膦转基因大豆及加工品LAMP检测研究[J]. 刘彩霞,梁成珠,徐彪,高宏伟,林超,孙敏. 大豆科学. 2009(02)
硕士论文
[1]哈密瓜细菌性叶斑病病原鉴定及不同品种抗病性测定[D]. 高润蕾.内蒙古农业大学 2009
本文编号：3276442
【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１下香假单胞黄瓜致病变种为害黄瓜和甜瓜图（张吉光等，２０１０）??Ｆｉｇ．?１．?Ｃｕｃｕｍｂｅｒ?ａｎｄ?ｍｅｌｏｎ?ｉｎｆｅｃｔｅｄ?从如所０口幻５?巧ｒ／巧各口ｅ?Ｐ乂?／幻幻７ＴＳ??
巧光定量ＰＣＲ拥有ＴａｑＭａｎ探针检测和ＳＹＢＲ?Ｇｒｅｅｎ?Ｉ检测两种检测模式。有５＇—３’外切核酸酶活性的Ｔａｑ酶是ＴａｑＭａｎ探针的扩增原理，并将巧光标记加入反应体系中。常规ＴａｑＭａｎ探针在ＰＣＲ过程中不能被延伸，５＇端发射基光发射被３＇端巧灭基团抑制。ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ?Ｉ染料特异性很强只与双链ＤＮＡ小，发出芙光。当它从双链上释放出来时，巧光信号减弱，所Ｗ双链ＤＮＡ分子能通过巧光信号的强弱来进行判断。这项技术也存在一定的缺点，它能与非恃双链ＤＮＡ结合造成假阳性结果（欧阳松应等，２００４）??．７?Ｐａｄｌｏｃｋ?探针??Ｐａｄｌｏｃｋ探针是一条长的寡聚核昔酸链，长度为ｌ（Ｍ３ｂｐ左右，探针两端（憐酸化和経基化的３端）能与目的片段进行特异性的结合。探针两端称为Ｔ１端和Ｔ２端，两端有很强的特异性，只有与目标片段完全匹配时，其在连接酶的作用下，探与祀标片段互补形成环状。为了使这项技术用于病原菌的诊断，Ｍａｒｉａｎｎａ?Ｓｚｅ人对如何保证高特异性和在实际检测中没有目的祀标的情况下如何消除自身应进行了优化。将Ｔ１端和Ｔ２端设计成不对称的两端，并且Ｔ２端（３端）明思短（５端）（Ｍａｒｉａｎｎａ?Ｓｚｅｍｅｓ等?２００５）。??Ｐａｄｌｏｃｋ?ｐｒｏｂｅ??
图３?ＬＡＭ巧Ｉ物合成图（Ｊｕｎ化２００９）??Ｆｉｇ３．?Ｐｒｉｍｅｒ?ｆｏｒ?ＬＡＭＰ??ＡＭＰ的反应机制可Ｗ分为Ｈ个部分。初始阶段为合成哑铃形结构阶段、循环Ｗ及再循环阶段，最后会产生大小不一的花挪菜状茎－环ＤＮＡ。ＬＡＭＰ采用的换活性，引物由两个内引物（ＦＩＰ，ＢＩＰ）及两个外引物（Ｆ３，?Ｂ３）构成，其视标ＤＮＡ上的６个特异性位点。只有当餓标上这６个特异位点彼四条引物完全，才能进行扩增（Ｙａｓｕｙｏｓｈｉ?Ｍｏｒｉ，?２００９）。??作为一种新型的高特异性和快速的检测方法，环介导等温扩增（ｌａｍｐ）已经用于各种领域。在最初的发展阶段，ＬＡＭＰ运用于检测食品上的一些病原菌，??沙口氏菌，李斯特菌，志贺菌属，大肠杆菌，弯曲杆菌的ｌａｍｐ试剂盒已经商ＡＭＰ也被广泛运用于动物疫病检测中。Ｉｗａｍｏｔｏ创建了分支杆菌属的检测体系，海创建了日蹄疫病毒的ＲＴ－ＬＡＭＰ检测方法，Ｚｈａｎｇ等同样运用ＲＴ－ＬＡＭＰ方法猪癌病毒的检测体系（杨德全等，２０１１）。ＬＡＭＰ在植物病原菌的检测中发挥极用。化ｍｌｉｎｓｏｎ等将艮ｅａｌｔｉｍｅＰＣ民与ＬＡＭＰ想结合，建立Ｒｅａｌｔｉｍｅ－ＬＡＭＰ检测体速用于灰霉病菌的检测。Ｎｉｅｓｓｅｎ等运用ＬＡＭＰ技术能在３０ｍｉｎ成功的从大麦种
【参考文献】：
期刊论文
[1]黄瓜棒孢叶斑病菌PCR检测方法的建立[J]. 陈璐,石延霞,谢学文,柴阿丽,李宝聚. 园艺学报. 2014(03)
[2]黄瓜细菌性角斑病的分子检测[J]. 王平,樊金娟,刘长远,赵奎华,梁春浩. 中国农学通报. 2012(25)
[3]环介导等温扩增法检测转基因玉米MON89034[J]. 张隽,李志勇,叶宇鑫,黄韵,刘津,余以刚,高东微,石磊. 现代食品科技. 2012(04)
[4]应用PCR方法快速检测黄瓜细菌性角斑病菌[J]. 王哲,陈青,田茜,李志红,朱水芳,赵文军. 植物检疫. 2011(06)
[5]黄瓜细菌性角斑病发病症状及综合防治技术[J]. 史云国. 上海蔬菜. 2011(03)
[6]瓜类细菌性果斑病研究进展[J]. 阎莎莎,王铁霖,赵廷昌. 植物检疫. 2011(03)
[7]黄瓜细菌性角斑病菌的分离与鉴定[J]. 张吉光,陈璐,张管曲,胡小平,王保通. 西北农业学报. 2010(12)
[8]免疫吸附PCR技术提高梨火疫病菌检测灵敏度[J]. 苏梅华,吴建波,李秋英,卢玲,胡白石. 植物检疫. 2010(03)
[9]环介导等温扩增（LAMP）技术的应用研究[J]. 刘永生,丁耀忠,张杰. 中国农学通报. 2010(08)
[10]抗草甘膦转基因大豆及加工品LAMP检测研究[J]. 刘彩霞,梁成珠,徐彪,高宏伟,林超,孙敏. 大豆科学. 2009(02)
硕士论文
[1]哈密瓜细菌性叶斑病病原鉴定及不同品种抗病性测定[D]. 高润蕾.内蒙古农业大学 2009
本文编号：3276442
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