调控蛋白AbrB对枯草芽孢杆菌B579芽孢生成影响的研究
发布时间：2021-07-25 00:05
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一类广泛存在于自然界的细菌,它对多种植物病原菌都具有拮抗性,而且对环境具有很强的适应性,部分枯草芽孢杆菌能够产生抗逆、耐热的芽孢,有利于其生防菌剂的生产、加工和储存,具有良好的应用前景。AbrB是枯草芽孢杆菌芽孢生成过程中主要调控蛋白之一,能够抑制芽孢的生成。本论文以前期筛选到的生防细菌枯草芽孢杆菌B579基因组为模板克隆得到了AbrB基因,对其序列进行了分析,进一步利用基因工程的方法构建重组表达质粒,实现了AbrB在枯草芽孢杆菌B579中的诱导表达,并研究了AbrB诱导表达对芽孢生成的影响,为高芽孢浓度生防菌剂的生产奠定基础。优化了枯草芽孢杆菌B579的质粒的电击转化条件,在培养基中添加甘氨酸至终浓度0.65 mmol/mL,当细胞生长至OD600为0.8时收集菌体,制作感受态细胞,感受态细胞浓缩30倍,使用1 mm的电转杯在2 kV的电压下转化,转化效率达到4×10。transformants/μg DNA。根据GenBank已报道的枯草芽孢杆菌BS168调控蛋白AbrB基因序列设计引物,以枯草芽孢杆菌B579基因组为模版,利用P...
【文章来源】：天津科技大学天津市
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTACT
英文缩略表
1 前言
1.1 植物病害的生物防治
1.2 生防芽孢杆菌研究以及应用概况
1.2.1 国外生防芽孢杆菌研究以及应用概况
1.2.2 国内生防枯草芽孢杆菌研究以及应用概况
1.3 枯草芽孢杆菌芽孢特性以及形成机理
1.3.1 芽孢结构与特性
1.3.2 芽孢形成机理
1.3.3 影响芽孢形成的因素和芽孢形成条件的优化
1.3.4 芽孢形成的关键基因
1.4 本论文研究的目的意义及主要内容
1.4.1 本论文研究的目的和意义
1.4.2 本论文研究的主要内容
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌种及质粒
2.1.2 主要实验仪器
2.1.3 工具酶及相关试剂
2.1.4 培养基
2.1.5 主要溶液
2.2 实验方法
2.2.1 枯草芽孢杆菌B579的培养
2.2.2 枯草芽孢杆菌B579的摇瓶发酵
2.2.3 枯草芽孢杆菌B579基因组的提取方法
2.2.4 碱裂解抽提法提取质粒方法
2.2.5 枯草芽孢杆菌B579电转感受态细胞的制作及电转化方法
2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法
2.2.7 调控蛋白AbrB基因的克隆
2.2.8 枯草芽孢杆菌表达载体pHY-P43-AbrB的构建
2.2.9 枯草芽孢杆菌B579/pHY-P43-AbrB质粒遗传稳定性测定
2.2.10 枯草芽孢杆菌重组质粒pDG148-AbrB的构建
2.2.11 聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.2.12 调控蛋白AbrB蛋白功能鉴定
2.2.13 调控蛋白AbrB在B579/pDG148-AbrB中的诱导表达
2.2.14 乳糖最佳添加量的确定
2.2.15 发酵过程中芽孢浓度变化
2.2.16 菌体浓度的测定
2.2.17 活菌总数的测定
2.2.18 芽孢浓度的测定
2.2.19 芽孢形成率
2.2.20 乳糖的测定方法(DNS法)
3 结果与讨论
3.1 枯草芽孢杆菌B579 AbrB基因的克隆
3.1.1 枯草芽孢杆菌B579基因组DNA的提取
3.1.2 调控蛋白AbrB基因序列分析
3.2 枯草芽孢杆菌B579电转化条件的优化
3.2.1 甘氨酸最适添加量的确定
3.2.2 感受态细胞最适生长状态的确定
3.2.3 最适电击电压的确定
3.2.4 感受态细胞浓度的确定
3.2.5 质粒DNA浓度对转化效率的影响
3.3 调控蛋白AbrB蛋白功能的初步鉴定
3.3.1 重组质粒pHY-P43-AbrB的构建
3.3.2 枯草芽孢杆菌B579/pHY-P43-AbrB质粒稳定性测定
3.3.3 全细胞SDS-PAGE检测AbrB在B579/pHY-P43-AbrB中的表达
3.3.4 调控蛋白AbrB蛋白功能鉴定
3.4 乳糖诱导调控芽孢生成
3.4.1 重组表达质粒pDG148-AbrB构建流程
3.4.2 全细胞SDS-PAGE检测AbrB在B579/pDG148-AbrB中的表达
3.4.3 利用乳糖在发酵过程中调控芽孢生成
4 结论
5 展望
6 参考文献
7 攻读硕士期间发表论文情况
8 致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]生防细菌防治土传病害的研究进展[J]. 杨秀荣,刘水芳,孙淑琴,刘义学,张学文,张惟. 天津农业科学. 2008(04)
[2]金属离子浓度对枯草芽孢杆菌芽孢率的影响[J]. 姚露燕,张水华,曹昱,王永华. 现代食品科技. 2008(08)
[3]大肠杆菌JM109菌株高效电转化条件的研究[J]. 冯建成,崔贞华,罗素兰. 湖北大学学报(自然科学版). 2008(01)
[4]影响大肠杆菌电转化效率因素的探讨[J]. 张晓楠,肖玉,黄勇,张秀敏,王涛,王丽,关璐媛,赵玮钦. 中国现代医学杂志. 2008(04)
[5]培养条件对枯草芽孢杆菌B68芽孢产量的影响[J]. 宋卡魏,王星云,张荣意. 中国生物防治. 2007(03)
[6]细菌芽孢:自然界抗性最强的生命体[J]. 周耘冰,何志学. 陕西师范大学学报(自然科学版). 2006(S1)
[7]益生枯草芽孢杆菌MA139增殖培养基的优化[J]. 郭小华,陆文清,邓萍,黄德仕. 中国农业大学学报. 2006(03)
[8]电转化条件对大肠杆菌XL1-Blue菌株转化效率的影响[J]. 韦晓明,苏明权,杨安钢,赵晶,温伟红,郝晓柯. 生物技术通讯. 2003(06)
[9]农用微生物杀菌剂研究进展[J]. 赵继红,李建中. 农药. 2003(05)
[10]生物农药的现状与发展趋势[J]. Philip Jarvis,关爱莹,刘长令. 农药科学与管理. 2002(03)
硕士论文
[1]产细菌纤维素菌株选育及细菌纤维素性质研究[D]. 朱明阳.南京理工大学 2004
本文编号：3301701
【文章来源】：天津科技大学天津市
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTACT
英文缩略表
1 前言
1.1 植物病害的生物防治
1.2 生防芽孢杆菌研究以及应用概况
1.2.1 国外生防芽孢杆菌研究以及应用概况
1.2.2 国内生防枯草芽孢杆菌研究以及应用概况
1.3 枯草芽孢杆菌芽孢特性以及形成机理
1.3.1 芽孢结构与特性
1.3.2 芽孢形成机理
1.3.3 影响芽孢形成的因素和芽孢形成条件的优化
1.3.4 芽孢形成的关键基因
1.4 本论文研究的目的意义及主要内容
1.4.1 本论文研究的目的和意义
1.4.2 本论文研究的主要内容
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌种及质粒
2.1.2 主要实验仪器
2.1.3 工具酶及相关试剂
2.1.4 培养基
2.1.5 主要溶液
2.2 实验方法
2.2.1 枯草芽孢杆菌B579的培养
2.2.2 枯草芽孢杆菌B579的摇瓶发酵
2.2.3 枯草芽孢杆菌B579基因组的提取方法
2.2.4 碱裂解抽提法提取质粒方法
2.2.5 枯草芽孢杆菌B579电转感受态细胞的制作及电转化方法
2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法
2.2.7 调控蛋白AbrB基因的克隆
2.2.8 枯草芽孢杆菌表达载体pHY-P43-AbrB的构建
2.2.9 枯草芽孢杆菌B579/pHY-P43-AbrB质粒遗传稳定性测定
2.2.10 枯草芽孢杆菌重组质粒pDG148-AbrB的构建
2.2.11 聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.2.12 调控蛋白AbrB蛋白功能鉴定
2.2.13 调控蛋白AbrB在B579/pDG148-AbrB中的诱导表达
2.2.14 乳糖最佳添加量的确定
2.2.15 发酵过程中芽孢浓度变化
2.2.16 菌体浓度的测定
2.2.17 活菌总数的测定
2.2.18 芽孢浓度的测定
2.2.19 芽孢形成率
2.2.20 乳糖的测定方法(DNS法)
3 结果与讨论
3.1 枯草芽孢杆菌B579 AbrB基因的克隆
3.1.1 枯草芽孢杆菌B579基因组DNA的提取
3.1.2 调控蛋白AbrB基因序列分析
3.2 枯草芽孢杆菌B579电转化条件的优化
3.2.1 甘氨酸最适添加量的确定
3.2.2 感受态细胞最适生长状态的确定
3.2.3 最适电击电压的确定
3.2.4 感受态细胞浓度的确定
3.2.5 质粒DNA浓度对转化效率的影响
3.3 调控蛋白AbrB蛋白功能的初步鉴定
3.3.1 重组质粒pHY-P43-AbrB的构建
3.3.2 枯草芽孢杆菌B579/pHY-P43-AbrB质粒稳定性测定
3.3.3 全细胞SDS-PAGE检测AbrB在B579/pHY-P43-AbrB中的表达
3.3.4 调控蛋白AbrB蛋白功能鉴定
3.4 乳糖诱导调控芽孢生成
3.4.1 重组表达质粒pDG148-AbrB构建流程
3.4.2 全细胞SDS-PAGE检测AbrB在B579/pDG148-AbrB中的表达
3.4.3 利用乳糖在发酵过程中调控芽孢生成
4 结论
5 展望
6 参考文献
7 攻读硕士期间发表论文情况
8 致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]生防细菌防治土传病害的研究进展[J]. 杨秀荣,刘水芳,孙淑琴,刘义学,张学文,张惟. 天津农业科学. 2008(04)
[2]金属离子浓度对枯草芽孢杆菌芽孢率的影响[J]. 姚露燕,张水华,曹昱,王永华. 现代食品科技. 2008(08)
[3]大肠杆菌JM109菌株高效电转化条件的研究[J]. 冯建成,崔贞华,罗素兰. 湖北大学学报(自然科学版). 2008(01)
[4]影响大肠杆菌电转化效率因素的探讨[J]. 张晓楠,肖玉,黄勇,张秀敏,王涛,王丽,关璐媛,赵玮钦. 中国现代医学杂志. 2008(04)
[5]培养条件对枯草芽孢杆菌B68芽孢产量的影响[J]. 宋卡魏,王星云,张荣意. 中国生物防治. 2007(03)
[6]细菌芽孢:自然界抗性最强的生命体[J]. 周耘冰,何志学. 陕西师范大学学报(自然科学版). 2006(S1)
[7]益生枯草芽孢杆菌MA139增殖培养基的优化[J]. 郭小华,陆文清,邓萍,黄德仕. 中国农业大学学报. 2006(03)
[8]电转化条件对大肠杆菌XL1-Blue菌株转化效率的影响[J]. 韦晓明,苏明权,杨安钢,赵晶,温伟红,郝晓柯. 生物技术通讯. 2003(06)
[9]农用微生物杀菌剂研究进展[J]. 赵继红,李建中. 农药. 2003(05)
[10]生物农药的现状与发展趋势[J]. Philip Jarvis,关爱莹,刘长令. 农药科学与管理. 2002(03)
硕士论文
[1]产细菌纤维素菌株选育及细菌纤维素性质研究[D]. 朱明阳.南京理工大学 2004
本文编号：3301701
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/nykj/3301701.html
