东方粘虫U6启动子的克隆及对V-ATPase B亚基基因沉默的研究

发布时间：2017-04-29 23:13

  本文关键词：东方粘虫U6启动子的克隆及对V-ATPase B亚基基因沉默的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术不仅可以用于昆虫基因功能的研究,还可以用于田间害虫的防治。V-ATP酶(vacular-type ATPase,V-ATPase)是生物体内普遍存在的一种酶,它是以水解ATP为能量跨膜转运H+的质子泵,为生物体保持正常的功能发挥着重要作用。对V-ATPase基因的任何干扰都会影响它的活性,进而影响生物的生存。U6启动子是介导小干扰RNA(small interference RNA,si RNA)表达的启动子,其驱动的短发夹RNA(short hairpin,shRNA)表达载体能在细胞内合成大量的siRNA,导致目的基因沉默。本研究利用染色体步移(Chromosome Walking)技术克隆得到东方粘虫(Mythimna separata)U6启动子序列,并通过生物信息学及细胞转染的方法对该序列进行分析和功能验证。该序列全长1 426 bp,包含八聚体序列(OCT),SPH元件,远端序列元件(DSE),近端序列元件(PSE)及TATAbox等RNA聚合酶Ⅲ启动子的特征元件。细胞转染表明该序列能成功驱动shRNA的表达,具有U6启动子活性。根据东方粘虫V-ATPase B亚基基因序列,设计并获得shRNA,将其与U6启动子构建到昆虫杆状病毒转移载体上,得到重组昆虫杆状病毒转移载体,并通过细胞转染的方式获得包含目的基因的昆虫杆状病毒。PCR及测序结果表明重组杆状病毒能够稳定遗传。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了重组杆状病毒对东方粘虫V-ATPase B亚基基因的影响。结果显示,B亚基基因相对表达量显著降低,表明重组杆状病毒能在东方粘虫体内繁殖并表达目的基因。本研究成功克隆了东方粘虫的U6启动子,并构建了由其驱动的昆虫杆状病毒表达载体,得到了具有沉默东方粘虫V-ATPase B亚基基因效应的杆状病毒,同时也证明了该杆状病毒具有遗传稳定性,为利用RNAi技术防治东方粘虫及其他害虫提供了参考。
【关键词】：东方粘虫 V-ATPase RNAi U6启动子
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S433.4
【目录】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-10
• 第一章 文献综述10-17
• 1.1 前言10
• 1.2 东方粘虫概述10-11
• 1.3 昆虫的V-ATPase11
• 1.4 RNAi技术的机制及应用11-14
• 1.4.1 RNAi现象的概述11-12
• 1.4.2 RNAi技术的分子机制12-13
• 1.4.3 RNAi技术的特点及应用13-14
• 1.5 RNA聚合酶III启动子14-16
• 1.5.1 RNA聚合酶III启动子的分类与结构15
• 1.5.2 RNA聚合酶III启动子的应用15-16
• 1.6 本研究的目的与意义16-17
• 第二章 东方粘虫U6启动子的克隆及功能验证17-29
• 2.1 前言17
• 2.2 材料与试剂17-18
• 2.2.1 主要材料与试剂17
• 2.2.2 主要仪器17-18
• 2.3 试验方法18-21
• 2.3.1 染色体步移引物设计与合成18
• 2.3.2 东方粘虫基因组DNA的提取18
• 2.3.3 染色体步移文库的建立18
• 2.3.4 PCR扩增18-20
• 2.3.5 PCR产物纯化20
• 2.3.6 测序20
• 2.3.7 U6启动子的shEGFP重组载体的构建20-21
• 2.4 结果分析21-27
• 2.4.1 巢式PCR21-23
• 2.4.2 U6 snRNA基因上游 5′侧翼序列分析23-25
• 2.4.3 pMD18-N载体的双酶切检测25
• 2.4.4 shEGFP的获得25-26
• 2.4.5 U6启动子的克隆及载体的构建26-27
• 2.4.6 RNAi载体转染 293T细胞的荧光显微镜检测27
• 2.5 小结与讨论27-29
• 第三章 昆虫杆状病毒表达载体的构建29-43
• 3.1 前言29
• 3.2 材料与试剂29
• 3.2.1 主要材料29
• 3.2.2 主要仪器29
• 3.3 实验方法29-34
• 3.3.1 昆虫杆状病毒转移载体的构建29-32
• 3.3.2 重组昆虫杆状病毒的转染32-33
• 3.3.3 重组昆虫杆状病毒遗传稳定性33-34
• 3.4 结果分析34-41
• 3.4.1 pBacPAK9-的获得34-35
• 3.4.2 U6-的获得35
• 3.4.3 BshRNA的获得35-36
• 3.4.4 昆虫杆状病毒转移载体的构建36-37
• 3.4.5 重组昆虫杆状病毒37-38
• 3.4.6 重组昆虫杆状病毒遗传稳定性38-40
• 3.4.7 对东方粘虫RNAi效果检测40-41
• 3.5 小结与讨论41-43
• 第四章 结论43-44
• 参考文献44-49
• 附录49-55
• 缩略词55-56
• 致谢56-57
• 作者简介57

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1 王高振;东方粘虫U6启动子的克隆及对V-ATPase B亚基基因沉默的研究[D];西北农林科技大学;2016年

  本文关键词：东方粘虫U6启动子的克隆及对V-ATPase B亚基基因沉默的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：335798