茶园土壤中真菌反硝化作用的研究

发布时间：2017-04-30 22:06

  本文关键词：茶园土壤中真菌反硝化作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：氧化亚氮(N20)是受《京都议定书》控制的地球大气中最主要的温室气体之一,它对地球臭氧层造成严重破坏,进而对人类及其他生物的生境安全构成威胁。地球最主要的N20气体的排放来自土壤,占到大气N20气体总排放量的65%。茶园土壤作为我国典型且特殊的农业土壤类型,分布范围和面积广泛。因人们追求茶园的经济效益以及茶叶的品质等,导致我国茶园对于氮素化肥的投入量巨大。长期以来,茶园土壤被施用过量的氮肥,造成茶园土壤严重酸化,并向大气中排放大量的温室气体N2O。土壤排放的N20气体与土壤中的微生物活动息息相关,而在高度酸化的茶园土壤中,微生物的反硝化作用占据主要地位。长期以来,国内外学者对于温室气体N20的研究多集中于水稻田等其他农业生态系统,对于茶园的研究也多集中在茶叶品质、茶园产量和管理等方面,对于茶园土壤N20气体的排放等相关研究较少。本研究选用我国著名的绿茶产地——浙江省杭州市西湖区梅家坞植茶约100年的茶园土壤作为供试样品。在实验室条件下,首先系统的完成了土壤基本理化性质、土壤N20排放量等方面的测定。同时,通过分别添加细菌抑制剂链霉素、真菌抑制剂放线菌酮,确定了100年茶园土壤中真菌反硝化作用对该土壤N20排放的贡献比例。其次,运用研究土壤微生物传统的分离方法,并结合现代分子生物学的先进技术和分析手段,通过构建土壤真菌18S ribosomaI RNA(18S rRNA)基因克隆文库,对供试土壤样品中的真菌多样性等进行分析研究,确定真菌反硝化作用对茶园土壤N20气体排放的贡献并分离得到一株反硝化真菌,命名为TF-1。最后,对真菌TF-1在不同生境条件下产生N20的能力进行比较,确定所分离真菌进行反硝化作用的最适条件。本研究主要结果如下：1.供试的100年茶园土壤为强酸性土壤,其pH仅为3.8,其N20释放量在实验室条件下测得高达37.80 ppm,是对照组某荒地土壤N20释放量(1.43 ppm)的26.43倍。2.通过向100年茶园土壤中分别添加不同的抑制剂,明确了100年茶园土壤中真菌的反硝化作用是该土壤N20释放的主要来源。链霉素作为抑制细菌的抑制剂,使得土壤N20气体的排放量下降了29%,为7.69 mg/kg;而放线菌酮作为真菌的抑制剂,使得土壤N20气体的排放下降了63%,仅为2.98mg/kg。3.实验室条件下,从供试土壤中分离、筛选并纯化得到一株耐强酸性、好氧反硝化真菌菌株,命名为TF-1,该菌株属于青霉菌属,子囊菌门。该真菌菌株仅能利用N03-作为氮源进行反硝化作用产生N20气体,且对于苹果酸以及果糖、葡萄糖等单糖的利用效率高于蔗糖等较复杂的有机物。4.通过构建18S rRNA基因土壤真菌克隆文库,分析发现100年茶园土壤中真菌的多样性较高,共分为22个OTU (Operational taxonomic unit),归属于五个真菌亚门,分别为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、毛霉亚门(Mucoromycotina)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)。本研究中所分离的真菌TF-1在供试的土壤中,有较高的相对丰度,在120个克隆子中有4条为该真菌序列,进而证明该真菌对于100年茶园土壤N20气体的释放具有一定的贡献值。
【关键词】：N_2O气体 真菌 反硝化作用 茶园土壤 N_2O排放 18S rRNA基因 温室气体
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S571.1;S154.3
【目录】：

• 摘要9-11
• Abstract11-13
• 第一章 绪论13-24
• 1.1 土壤N_2O排放的主要来源13-16
• 1.1.1 硝化作用14-15
• 1.1.2 反硝化作用15-16
• 1.2 茶园土壤的生物学特征16-17
• 1.3 土壤微生物研究方法17-21
• 1.3.1 传统方法18-19
• 1.3.2 现代分子生物学方法19-21
• 1.3.3 生物化学方法21
• 1.4 研究背景、目的21-24
• 1.4.1 研究背景21-22
• 1.4.2 研究目的22-24
• 第二章 100年茶园土壤N_2O的释放与真菌反硝化作用的贡献研究24-37
• 2.1 前言24
• 2.2 材料与方法24-28
• 2.2.1 供试土壤24-25
• 2.2.2 实验室条件下土壤释放N_2O的测定25-28
• 2.3 结果与讨论28-37
• 2.3.1 土壤基本理化性质28-30
• 2.3.2 土壤微生物量30
• 2.3.3 土壤反硝化潜势30-32
• 2.3.4 土壤微生物群落水平生理特征32-33
• 2.3.5 土壤N_2O释放量33-34
• 2.3.6 土壤中真菌反硝化作用的贡献34-37
• 第三章 100年茶园土壤反硝化真菌的分离、鉴定与产N_2O测定37-51
• 3.1 前言37-41
• 3.2 材料与方法41-45
• 3.2.1 供试土壤41
• 3.2.2 培养基与主要试剂的配制41-42
• 3.2.3 菌株的分离、筛选与纯化42
• 3.2.4 真菌DNA的提取和18S rDNA的PCR扩增与测序42-44
• 3.2.5 真菌菌株反硝化能力测定44
• 3.2.6 真菌亚硝酸盐还原酶基因nirK的PCR扩增44-45
• 3.3 结果45-51
• 3.3.1 菌株分离45
• 3.3.2 菌株形态观察45-46
• 3.3.3 真菌18S rDNA PCR扩增46-47
• 3.3.4 测序结果47-48
• 3.3.5 分子鉴定菌株TF-148-49
• 3.3.6 菌株TF-1获取GenBank序列号49
• 3.3.7 菌株TF-1反硝化能力49
• 3.3.8 功能基因nirK的PCR扩增49-51
• 第四章 100年茶园土壤真菌克隆文库的构建与反硝化真菌TF-1在文库中的分析51-61
• 4.1 前言51-52
• 4.2 材料与方法52-56
• 4.2.1 供试土壤52
• 4.2.2 茶园土壤DNA提取与18S rDNA的PCR扩增52-53
• 4.2.3 PCR产物的回收53-54
• 4.2.4 土壤真菌18S rRNA基因克隆文库构建54-56
• 4.3 结果与分析56-61
• 4.3.1 土壤真菌18S rRNA基因克隆文库测序结果分析56-59
• 4.3.2 反硝化真菌TF-1在克隆文库中的分析59-61
• 第五章 培养条件对反硝化真菌TF-1产N_2O的影响与土壤接种实验61-70
• 5.1 前言61-62
• 5.2 培养条件对反硝化真菌TF-1产N_2O的影响62-67
• 5.2.1 不同温度条件下反硝化真菌TF-1产N_2O的比较62-63
• 5.2.2 不同pH条件下反硝化真菌TF-1产N_2O的比较63-65
• 5.2.3 不同碳源条件下反硝化真菌TF-1产N_2O的比较65-66
• 5.2.4 不同氮源条件下反硝化真菌TF-1产N_2O的比较66-67
• 5.3 反硝化真菌TF-1的土壤接种实验67-68
• 5.3.1 100年茶园土壤的辐照灭菌67-68
• 5.3.2 土壤接种实验68
• 5.4 结果68-70
• 5.4.1 反硝化真菌TF-1产生N_2O的最适培养条件68
• 5.4.2 100年茶园土壤中反硝化真菌TF-1产生N_2O的能力68-70
• 第六章 研究展望70-71
• 参考文献71-84
• 硕士学位期间学术成果及获奖情况84-85
• 致谢85-86

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