稻瘟病菌Ypt5两个同源基因的功能分析
发布时间：2021-09-27 20:58
稻瘟病菌能够侵染以水稻为主的众多重要农作物,同时也是研究丝状真菌的生长、发育和致病性的重要模式生物。作为机体重要分子开关的Rab GTP酶是Ras超家族的其中一员。在酿酒酵母中有三类Rab5家族蛋白,Ypt51,Ypt52,Ypt53,在胞吞和囊泡融合等方面起重要作用。MoYpt51（MGG06241）和MoYpt52(MGG 是稻瘟病菌中与酿酒酵母的Ypt51和Ypt52同源的两个基因。为了研究这两个蛋白的功能,我们分别构建了 MoYpt51/52的正显性激活载体（constitutively active,CA）和负显性失活载体（dominantly negative,DN）,并把它们分别转入到野生型菌株Guy11中,最终得到突变体Mo Ypt51/52-C4/DN,并对其进行了表型分析。所有突变体的生长速率都显著减慢,完全丧失了产孢能力,用突变体的菌丝块分别对造伤和正常的大麦、水稻叶片进行离体接种,均不致病。Mo Ypt51/52-C4/DN突变体囊泡融合受阻,丧失了顶体结构,有性生殖也被阻断。为了进一步分析MoYpt51/52的功能,我们获得了这两个基因的...
【文章来源】：福建农林大学福建省
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１实验所用质粒图谱??Ｆｉｇ．?１?Ｔｈｅ?ｍａｐｓ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄｓ?ｕｓｅｄ?ｉｎ?ｔｈｉｓ?ｓｔｕｄｙ??６??
?福建农林大学硕士学位论文???（ＲａｂＳＦｌ－ＳＦ４）。在这些蛋白的Ｃ端还具有明显的半胱氨酸ｍｏｔｉｆｓ?（通常以??ＣＸＸＸ，ＣＣＸＸ，ＸＣＸＣ，ＸＸＣＣ的形式存在），它们可以被异戊烯化，从而引导??Ｒａｂ蛋白的膜定位。??１?〇ｑ?Ｒａｂ－５Ａ??６６??Ｒａｂ－５Ｂ???ＭｏＹｐｔ５２???ＭｏＹｐｔ５１??９７１?Ｙｐｔ５１???Ｙｐｔ５２??Ｉ?１??０．０５??图３?Ｒａｂ５的在３个物种中的系统发育树??Ｆｉｇ．３?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ｏｆ?Ｒａｂ５?ｉｎ?ｔｈｒｅｅ?ｓｐｅｃｉｅｓ??将３个物种Ｒａｂ５蛋白的氨基酸序列进行比对，并用ＤＮＡｍａｎ软件构建了的??系统发育树（图２），发现人类的Ｒａｂ５Ａ和Ｒａｂ５Ｂ的同源性极高，同时稻瘟病菌??的ＭｏＹｐｔ５２和人类的Ｒａｂ５在进化上比较接近，稻瘟病菌的ＭｏＹｐｔ５１和酵母的??Ｙｐｔ５１在进化上则较为接近。说明稻瘟病菌里面的这两个Ｒａｂ蛋白在进化上处于??不同的阶段，ＭｏＹｐｔ５１相对ＭｏＹｐｔ５２来说比较保守。??３．３酿酒酵母Ｙｐｔ５１单倍体敲除突变体的分离??＋?咖?Ｈａｐｌｏｉｄ??Ｙｐｔ５２－ＯＲＦ｜＾＾?，???＾??Ｙｐｔ５１－〇ＲＦ＾?．．ｎ．—??图４酵母单倍体巧行／敲除突变体的验证??Ｆｉｇ．４?Ｔｈｅ?ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｈａｐｌｏｉｄ?ｋｎｏｃｋｉｎｇ?ｏｕｔ?ｏｆ?Ｙｐｔ５１?ｉｎ?Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ?ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ??对双倍体作／５７的单敲突变体（德国ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ）进行单倍体分离，经ＤＮＡ??提取和Ｙｐｔ５１的ＯＲＦ引物验证，结果只得到
?福建农林大学硕士学位论文???（ｚ／ｒｐ／５／＋ｐＹＥＳ２）在此培养基上均不能生长，这与先前的研究结果［３３］是一致的。??而未经分离的双倍体｝如５／的单敲突变体在含有ＣＦＷ的ＹＰＤＡ培养基上是可以??生长的（图５），据此，说明得到的单倍体敲除突变体是可靠的。??Ｄｉｐｌｏｉｄ?Ｙｐｔ５１??ｙｐｔ５２??ＹＰＤＡ?ＹＰＤＡ＋ＣＦＷ??图５二倍体｝＞／５７的单敲突变体对ＣＦＷ不敏感??Ｆｉｇ．５?Ｔｈｅ?ｓｉｎｇｌｅ?ｄｅｆｅｃｔ?ｏｆ?ｄｉｐｌｏｉｄ?Ｙｐｔ５１?ｉｓ?ｎｏｔ?ｓｅｎｓｉｂｌｅ?ｔｏ?ＣＦＷ??３．４相关载体的验证??３．４．１异源互补载体的验证??结合ｐＹＥＳ２上的引物和克隆片段木身的引物，分别验证从〇沙／５／和Ｍ？）丨Ｗ的??异源互补载体，得到相应的扩增片段（图６，?５１ＹＹ＋，５２ＹＹ＋），其大小都比克??？?？??７５０ｂｐ￣７１７ｂｐ??■?６６６ｂｐ??图６稻瘟病菌０／５异源互补载体的验证??Ｆｉｇ．６?Ｔｈｅ?ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓｌｙ?ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ?ｖｅｃｔｏｒｓ?ｏｆ?ＭｏＹｐｌ５??隆片段木身长度要稍大（存在载体上的一段核酸片段）。同时用ＢａｍＨ丨和ＥｃｏＲ?Ｉ??进行酶切验证，得到和克隆片段长度相同大小的条带（图６，?５１ＹＹＤｉｇｅＳｔｉ〇ｎ，??５２ＹＹＤｉｇｅＳｔｉｏｎ）。测序结果经序列比对，没有出现错义突变（她切／５／的异源互??补载体有一个碱基发生突变，但编码的氨基酸没有改变）和移码情况（图８Ｇ，??Ｈ）。以上结果表明Ｍｏ〗和５／和Ａ而｝＾５２的异源可．补载体构建成功。??２５??
【参考文献】：
期刊论文
[1]水稻稻瘟病菌研究进展[J]. 李杨,王耀雯,王育荣,于洁. 广西农业科学. 2010(08)
[2]水稻重要病虫草害综合防治核心技术[J]. 黄世文,王玲,黄雯雯,刘连盟. 中国稻米. 2009(02)
[3]中国水稻科技发展战略[J]. 程式华,胡培松. 中国水稻科学. 2008(03)
[4]水稻稻瘟病菌侵染途径研究综述[J]. 乐美旺,陈实,潘庆华,曾任森,骆世明. 江西农业学报. 2006(02)
[5]水稻稻瘟病菌有性世代形成条件的优化[J]. 张国珍,马秋娟,彭友良. 植物病理学报. 2002(02)
[6]水稻稻瘟病菌形成有性世代的培养条件初步研究[J]. 柴荣耀,金敏忠. 浙江农业科学. 1992(03)
本文编号：3410603
【文章来源】：福建农林大学福建省
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１实验所用质粒图谱??Ｆｉｇ．?１?Ｔｈｅ?ｍａｐｓ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄｓ?ｕｓｅｄ?ｉｎ?ｔｈｉｓ?ｓｔｕｄｙ??６??
?福建农林大学硕士学位论文???（ＲａｂＳＦｌ－ＳＦ４）。在这些蛋白的Ｃ端还具有明显的半胱氨酸ｍｏｔｉｆｓ?（通常以??ＣＸＸＸ，ＣＣＸＸ，ＸＣＸＣ，ＸＸＣＣ的形式存在），它们可以被异戊烯化，从而引导??Ｒａｂ蛋白的膜定位。??１?〇ｑ?Ｒａｂ－５Ａ??６６??Ｒａｂ－５Ｂ???ＭｏＹｐｔ５２???ＭｏＹｐｔ５１??９７１?Ｙｐｔ５１???Ｙｐｔ５２??Ｉ?１??０．０５??图３?Ｒａｂ５的在３个物种中的系统发育树??Ｆｉｇ．３?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ｏｆ?Ｒａｂ５?ｉｎ?ｔｈｒｅｅ?ｓｐｅｃｉｅｓ??将３个物种Ｒａｂ５蛋白的氨基酸序列进行比对，并用ＤＮＡｍａｎ软件构建了的??系统发育树（图２），发现人类的Ｒａｂ５Ａ和Ｒａｂ５Ｂ的同源性极高，同时稻瘟病菌??的ＭｏＹｐｔ５２和人类的Ｒａｂ５在进化上比较接近，稻瘟病菌的ＭｏＹｐｔ５１和酵母的??Ｙｐｔ５１在进化上则较为接近。说明稻瘟病菌里面的这两个Ｒａｂ蛋白在进化上处于??不同的阶段，ＭｏＹｐｔ５１相对ＭｏＹｐｔ５２来说比较保守。??３．３酿酒酵母Ｙｐｔ５１单倍体敲除突变体的分离??＋?咖?Ｈａｐｌｏｉｄ??Ｙｐｔ５２－ＯＲＦ｜＾＾?，???＾??Ｙｐｔ５１－〇ＲＦ＾?．．ｎ．—??图４酵母单倍体巧行／敲除突变体的验证??Ｆｉｇ．４?Ｔｈｅ?ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｈａｐｌｏｉｄ?ｋｎｏｃｋｉｎｇ?ｏｕｔ?ｏｆ?Ｙｐｔ５１?ｉｎ?Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ?ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ??对双倍体作／５７的单敲突变体（德国ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ）进行单倍体分离，经ＤＮＡ??提取和Ｙｐｔ５１的ＯＲＦ引物验证，结果只得到
?福建农林大学硕士学位论文???（ｚ／ｒｐ／５／＋ｐＹＥＳ２）在此培养基上均不能生长，这与先前的研究结果［３３］是一致的。??而未经分离的双倍体｝如５／的单敲突变体在含有ＣＦＷ的ＹＰＤＡ培养基上是可以??生长的（图５），据此，说明得到的单倍体敲除突变体是可靠的。??Ｄｉｐｌｏｉｄ?Ｙｐｔ５１??ｙｐｔ５２??ＹＰＤＡ?ＹＰＤＡ＋ＣＦＷ??图５二倍体｝＞／５７的单敲突变体对ＣＦＷ不敏感??Ｆｉｇ．５?Ｔｈｅ?ｓｉｎｇｌｅ?ｄｅｆｅｃｔ?ｏｆ?ｄｉｐｌｏｉｄ?Ｙｐｔ５１?ｉｓ?ｎｏｔ?ｓｅｎｓｉｂｌｅ?ｔｏ?ＣＦＷ??３．４相关载体的验证??３．４．１异源互补载体的验证??结合ｐＹＥＳ２上的引物和克隆片段木身的引物，分别验证从〇沙／５／和Ｍ？）丨Ｗ的??异源互补载体，得到相应的扩增片段（图６，?５１ＹＹ＋，５２ＹＹ＋），其大小都比克??？?？??７５０ｂｐ￣７１７ｂｐ??■?６６６ｂｐ??图６稻瘟病菌０／５异源互补载体的验证??Ｆｉｇ．６?Ｔｈｅ?ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓｌｙ?ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ?ｖｅｃｔｏｒｓ?ｏｆ?ＭｏＹｐｌ５??隆片段木身长度要稍大（存在载体上的一段核酸片段）。同时用ＢａｍＨ丨和ＥｃｏＲ?Ｉ??进行酶切验证，得到和克隆片段长度相同大小的条带（图６，?５１ＹＹＤｉｇｅＳｔｉ〇ｎ，??５２ＹＹＤｉｇｅＳｔｉｏｎ）。测序结果经序列比对，没有出现错义突变（她切／５／的异源互??补载体有一个碱基发生突变，但编码的氨基酸没有改变）和移码情况（图８Ｇ，??Ｈ）。以上结果表明Ｍｏ〗和５／和Ａ而｝＾５２的异源可．补载体构建成功。??２５??
【参考文献】：
期刊论文
[1]水稻稻瘟病菌研究进展[J]. 李杨,王耀雯,王育荣,于洁. 广西农业科学. 2010(08)
[2]水稻重要病虫草害综合防治核心技术[J]. 黄世文,王玲,黄雯雯,刘连盟. 中国稻米. 2009(02)
[3]中国水稻科技发展战略[J]. 程式华,胡培松. 中国水稻科学. 2008(03)
[4]水稻稻瘟病菌侵染途径研究综述[J]. 乐美旺,陈实,潘庆华,曾任森,骆世明. 江西农业学报. 2006(02)
[5]水稻稻瘟病菌有性世代形成条件的优化[J]. 张国珍,马秋娟,彭友良. 植物病理学报. 2002(02)
[6]水稻稻瘟病菌形成有性世代的培养条件初步研究[J]. 柴荣耀,金敏忠. 浙江农业科学. 1992(03)
本文编号：3410603
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