RacA与Cdc42调节双型真菌莱氏野村菌的极性生长和微菌核形成
发布时间：2021-10-12 21:28
虫生真菌是一种环境友好型真菌，在防治农林害虫时有对环境无污染、无残留和不易产生抗药性等优点。随着人们环保意识的增强，人们对环境友好型农药的研究也在逐渐加强。莱氏野村菌是一种重要的昆虫病原真菌，在田间能够侵染多种夜蛾科害虫并引起流行病。莱氏野村菌的有效成分为分生孢子，但是由于其产孢需要苛刻的营养和持续光照，限制了大规模生产。重庆大学生命科学学院微生物实验室采用诱导发酵技术培养出了微菌核，并对其的抗逆性和毒力等进行研究，证实微菌核可以代替分生孢子作为有效的活性成分。其后，采用比较转录组技术研究微菌核形成的分子机理，发现在微菌核形成过程中伴随着菌丝的极性生长和氧胁迫（ROS）的产生。本论文是从比较转录组上调表达的cDNA文库中挑取racA与cdc42基因，将其克隆并证明二者参与菌丝的极性生长和微菌核的形成。主要研究成果：①目标基因克隆鉴定：采用SMART RACE RT-PCR技术获得racA与cdc42的cDNA和基因组序列，ORF分别为657bp和555bp，各自编码218和184个氨基酸；②目标基因的生物信息学分析：采用生物信息学软件对蛋白序列进行分析发现，RacA与Cdc42蛋白都有...
【文章来源】：重庆大学重庆市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词
1 绪论
1.1 引言
1.2 立题依据
1.2.1 莱氏野村菌的研究进展
1.2.2 微菌核的研究进展
1.2.3 RacA 与 Cdc42 蛋白的研究进展
1.2.4 RacA、Cdc42 与 NADPH 复合体以及 ROS 之间关系的研究
1.3 研究目的
1.4 研究内容和技术路线
1.4.1 研究内容
1.4.2 技术路线
1.5 本研究创新之处
2 racA 和 cdc42 全长 cDNA 与基因组的克隆与分析
2.1 试验材料
2.1.1 试验用菌株
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要设备仪器
2.1.4 主要溶液和培养基的配制
2.2 主要试验方法
2.2.1 莱氏野村菌微菌核的培养
2.2.2 莱氏野村菌微菌核总 RNA 的提取
2.2.3 莱氏野村菌 RACE 技术的 cDNA 一链的获得
2.2.4 莱氏野村菌 RACE 技术的获得 cDNA 的全长
2.2.5 PCR 产物的测序
2.2.6 全长 cDNA 的测通及基因组的克隆
2.2.7 racA 和 cdc42 的生物信息学及进化分析
2.3 结果与分析
2.3.1 racA 与 cdc42 的 3'/5'RACE 的扩增
2.3.2 racA 与 cdc42 的基因组克隆和序列分析
2.3.3 RacA 与 Cdc42 蛋白生物信息学及进化关系分析
3 racA、cdc42、noxA 和 noxR 的表达模式分析
3.1 试验材料
3.1.1 试验菌株
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要设备及仪器
3.1.4 主要培养基
3.2 试验方法
3.2.1 微菌核形成的时期及材料收集
3.2.2 微菌核形成各个时期菌体 RNA 的提取及 cDNA 一链的合成
3.2.3 qPCR 引物设计
3.2.4 莱氏野村菌 racA、cdc42、noxA 和 noxR 的表达模式分析
3.2.5 qPCR 结果分析
3.3 试验结果与分析
3.3.1 微菌核形成的各个时期
3.3.2 racA 与 cdc42 的表达模式
3.3.3 noxA 与 noxR 的表达模式
4 RNAi 的方法研究 racA 与 cdc42 的功能
4.1 试验材料
4.1.1 试验菌株
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要设备仪器
4.1.4 主要培养基和溶液
4.2 主要试验方法
4.2.1 莱氏野村菌 racA 与 cdc42 干扰引物的设计
4.2.2 莱氏野村菌 racA 与 cdc42 干扰片段扩增
4.2.3 dsRNA 的体外合成
4.2.4 dsRNA 的纯化
4.2.5 dsRNA 的酶切消化
4.2.6 siRNA 的纯化
4.2.7 siRNA 的转化（改良的 PEG/Licl 的方法）
4.2.8 最适 siRNA 浓度的确定以及干扰效率的测定
4.2.9 菌落形态、菌丝两态型转变、孢子形态以及产孢量的测定
4.2.10 菌丝及微菌核形态、微菌核数量的测定
4.2.11 Reactive Oxygen Species (ROS)的检测
4.2.12 干扰后 NOX 复合体的表达模式
4.2.13 毒力生测
4.2.14 数据处理
4.3 试验结果与分析
4.3.1 最适 siRNA 浓度的确定以及干扰效率的测定
4.3.2 菌落形态、菌丝两态型转变、孢子形态以及产孢量的测定
4.3.3 菌丝及微菌核形态、微菌核数量的测定
4.3.4 ROS 的检测以及干扰后 NOX 复合体的表达模式
4.3.5 毒力生测
5 racA、cdc42、noxA、noxR 和 cdc24 之间关系初探
5.1 试验材料
5.2 试验方法
5.3 试验结果与分析
6 讨论
7 主要结论及后续工作
7.1 主要研究结论
7.2 后续试验建议
致谢
参考文献
附录 作者在攻读硕士学位期间发表论文的目录
【参考文献】：
期刊论文
[1]莱氏野村菌CQNr01微菌核的人工诱导培养[J]. 殷幼平,黄姗,宋章永,王中康. 中国农业科学. 2012(23)
[2]虫生真菌在农林害虫生物防治中的应用[J]. 王记祥,马良进. 浙江林学院学报. 2009(02)
[3]虫生真菌分子致病机理及基因工程改造研究进展[J]. 吕丁丁,李增智,王成树. 微生物学通报. 2008(03)
[4]中国虫生真菌应用50年简史（英文）[J]. 李增智. 安徽农业大学学报. 2007(02)
[5]虫生真菌对害虫防治的研究与应用[J]. 何恒果,李正跃,陈斌,文良柱. 云南农业大学学报. 2004(02)
本文编号：3433329
【文章来源】：重庆大学重庆市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词
1 绪论
1.1 引言
1.2 立题依据
1.2.1 莱氏野村菌的研究进展
1.2.2 微菌核的研究进展
1.2.3 RacA 与 Cdc42 蛋白的研究进展
1.2.4 RacA、Cdc42 与 NADPH 复合体以及 ROS 之间关系的研究
1.3 研究目的
1.4 研究内容和技术路线
1.4.1 研究内容
1.4.2 技术路线
1.5 本研究创新之处
2 racA 和 cdc42 全长 cDNA 与基因组的克隆与分析
2.1 试验材料
2.1.1 试验用菌株
2.1.2 主要试剂
2.1.3 主要设备仪器
2.1.4 主要溶液和培养基的配制
2.2 主要试验方法
2.2.1 莱氏野村菌微菌核的培养
2.2.2 莱氏野村菌微菌核总 RNA 的提取
2.2.3 莱氏野村菌 RACE 技术的 cDNA 一链的获得
2.2.4 莱氏野村菌 RACE 技术的获得 cDNA 的全长
2.2.5 PCR 产物的测序
2.2.6 全长 cDNA 的测通及基因组的克隆
2.2.7 racA 和 cdc42 的生物信息学及进化分析
2.3 结果与分析
2.3.1 racA 与 cdc42 的 3'/5'RACE 的扩增
2.3.2 racA 与 cdc42 的基因组克隆和序列分析
2.3.3 RacA 与 Cdc42 蛋白生物信息学及进化关系分析
3 racA、cdc42、noxA 和 noxR 的表达模式分析
3.1 试验材料
3.1.1 试验菌株
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要设备及仪器
3.1.4 主要培养基
3.2 试验方法
3.2.1 微菌核形成的时期及材料收集
3.2.2 微菌核形成各个时期菌体 RNA 的提取及 cDNA 一链的合成
3.2.3 qPCR 引物设计
3.2.4 莱氏野村菌 racA、cdc42、noxA 和 noxR 的表达模式分析
3.2.5 qPCR 结果分析
3.3 试验结果与分析
3.3.1 微菌核形成的各个时期
3.3.2 racA 与 cdc42 的表达模式
3.3.3 noxA 与 noxR 的表达模式
4 RNAi 的方法研究 racA 与 cdc42 的功能
4.1 试验材料
4.1.1 试验菌株
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要设备仪器
4.1.4 主要培养基和溶液
4.2 主要试验方法
4.2.1 莱氏野村菌 racA 与 cdc42 干扰引物的设计
4.2.2 莱氏野村菌 racA 与 cdc42 干扰片段扩增
4.2.3 dsRNA 的体外合成
4.2.4 dsRNA 的纯化
4.2.5 dsRNA 的酶切消化
4.2.6 siRNA 的纯化
4.2.7 siRNA 的转化（改良的 PEG/Licl 的方法）
4.2.8 最适 siRNA 浓度的确定以及干扰效率的测定
4.2.9 菌落形态、菌丝两态型转变、孢子形态以及产孢量的测定
4.2.10 菌丝及微菌核形态、微菌核数量的测定
4.2.11 Reactive Oxygen Species (ROS)的检测
4.2.12 干扰后 NOX 复合体的表达模式
4.2.13 毒力生测
4.2.14 数据处理
4.3 试验结果与分析
4.3.1 最适 siRNA 浓度的确定以及干扰效率的测定
4.3.2 菌落形态、菌丝两态型转变、孢子形态以及产孢量的测定
4.3.3 菌丝及微菌核形态、微菌核数量的测定
4.3.4 ROS 的检测以及干扰后 NOX 复合体的表达模式
4.3.5 毒力生测
5 racA、cdc42、noxA、noxR 和 cdc24 之间关系初探
5.1 试验材料
5.2 试验方法
5.3 试验结果与分析
6 讨论
7 主要结论及后续工作
7.1 主要研究结论
7.2 后续试验建议
致谢
参考文献
附录 作者在攻读硕士学位期间发表论文的目录
【参考文献】：
期刊论文
[1]莱氏野村菌CQNr01微菌核的人工诱导培养[J]. 殷幼平,黄姗,宋章永,王中康. 中国农业科学. 2012(23)
[2]虫生真菌在农林害虫生物防治中的应用[J]. 王记祥,马良进. 浙江林学院学报. 2009(02)
[3]虫生真菌分子致病机理及基因工程改造研究进展[J]. 吕丁丁,李增智,王成树. 微生物学通报. 2008(03)
[4]中国虫生真菌应用50年简史（英文）[J]. 李增智. 安徽农业大学学报. 2007(02)
[5]虫生真菌对害虫防治的研究与应用[J]. 何恒果,李正跃,陈斌,文良柱. 云南农业大学学报. 2004(02)
本文编号：3433329
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