褐飞虱内参基因的筛选及精氨酸激酶基因的分子特性研究

发布时间：2022-02-15 08:34

　　褐飞虱Nilaparvata lugens （brown planthopper, BPH）是水稻上的重要害虫之一,在我国南方部分地区和长江中下游地区近年来褐飞虱经常暴发成灾,对我国水稻生产和粮食安全构成严重威胁。目前,对于褐飞虱的控制以化学防治为主,然而化学药剂导致的环境污染问题日益严重,因此当前害虫防治的研究热点集中在寻求环境友好的防止新途径。与此同时,RNAi技术已经广泛地应用于各种生物体基因功能的研究,这一技术成功地阐明了多种昆虫的基因功能。利用该技术分析基因功能的同时,也为农业害虫的生物防治开辟了RNAi沉默靶标基因的新途径。在RNAi的研究过程中,利用实时荧光定量PCR分析靶标基因mRNA水平是检测基因沉默效果的重要手段,本研究详细分析评估了不同实验条件下（不同发育时期、不同组织部位、不同地理种群、不同温度胁迫、不同药剂处理、不同食物饲喂和饥饿处理）褐飞虱8种常用持家基因actin1（ACT）、muscle actin （MACT）、ribosomal protein S11（RPS11）、ribosomal protein S15e （RPS15）、alpha2-tubu... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省211工程院校教育部直属院校

【文章页数】：128 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1 褐飞虱的研究概况
    2 精氨酸激酶基因的研究
        2.1 磷酸原激酶概述
        2.2 精氨酸激酶的蛋白质结构
        2.3 精氨酸激酶的基因拷贝数及表达情况
        2.4 精氨酸激酶的进化过程
        2.5 精氨酸激酶与抗性的关系
    3 实时荧光定量PCR内参基因的筛选
        3.1 绝对定量分析和相对定量分析
        3.2 筛选内参基因
        3.3 数据分析方法
    4 昆虫的RNAi研究进展
        4.1 RNAi的作用机制
        4.2 介导双链RNA进入昆虫体内的方法
            4.2.1 微量注射法
            4.2.2 浸泡法
            4.2.3 组织培养法
            4.2.4 人工饲料饲喂法
            4.2.5 转基因植物介导法
        4.3 昆虫RNAi效率的影响因素
            4.3.1 导入方式
            4.3.2 dsRNA浓度
            4.3.3 dsRNA的设计
        4.4 昆虫RNAi的可遗传性
            4.4.1 亲本RNAi(partenal RANi)
            4.4.2 可遗传RNAi(heritable RNAi)
        4.5 RNAi在害虫防治中的应用
    5 本研究的目的和意义
第二章 材料与方法
    1 实验材料
        1.1 供试昆虫
        1.2 供试水稻
        1.3 菌株和载体
        1.4 主要仪器设备及耗材
        1.5 实验试剂
    2 研究方法
        2.1 常用试剂及培养基的配制
        2.2 褐飞虱人工饲料的配制及褐飞虱的人工饲喂方法
        2.3 水稻营养液的配制
        2.4 内参基因引物设计及初步筛选
        2.5 不同试验条件下的试虫及其cDNA模板的挑选
            2.5.1 不同发育时期
            2.5.2 不同组织部位
            2.5.3 不同地理种群
            2.5.4 不同温度处理
            2.5.5 不同杀虫剂处理
            2.5.6 不同饲料处理
            2.5.7 饥饿处理
            2.5.8 总RNA的提取和cDNA第一链合成
        2.6 内参基因稳定性的分析方法
            2.6.1 qRT-PCR方法
            2.6.2 数据处理和分析方法
        2.7 精氨酸激酶在褐飞虱体内的表达分析
            2.7.1 精氨酸激酶基因表达谱
            2.7.2 精氨酸激酶酶活性测定
        2.8 褐飞虱精氨酸激酶基因的克隆、5'-RACE和3'-RACE
            2.8.1 引物设计
            2.8.2 Trizol抽提褐飞虱总RNA
            2.8.3 纯化褐飞虱mRNA
            2.8.4 制备褐飞虱Marathon cDNA
            2.8.5 nlak基因的克隆
            2.8.6 nlak基因的5'-RACE和3'-RACE
        2.9 昆虫杆状病毒系统表达褐飞虱重组精氨酸激酶
            2.9.1 sf21细胞传代
            2.9.2 构建重组pBavAK8-nlak质粒
            2.9.3 重组Ac NPV-N1AK在昆虫杆状病毒中表达
            2.9.4 SDS-PAGE
            2.9.5 Western-Blotting
        2.10 制备dsRNA
            2.10.1 引物设计
            2.10.2 制备模板
            2.10.3 dsRNA的合成、纯化及检测
        2.11 dsRNA的饲喂
            2.11.1 dsRNA在人工饲料中的稳定性
            2.11.2 dsRNA使用浓度的确定
            2.11.3 dsRNA转入褐飞虱体内
        2.12 RNAi分析
        2.13 数据处理
第三章 结果与分析
    1 褐飞虱实时荧光定量PCR中内参基因的选择
        1.1 各候选内参基因的表达水平
        1.2 不同发育时期各内参基因表达稳定性分析
        1.3 不同组织部位各内参基因表达稳定性分析
        1.4 不同地理种群各内参基因表达稳定性分析
        1.5 不同温度处理下各内参基因表达稳定性分析
        1.6 不同药剂下各内参基因表达稳定性分析
        1.7 不同食物饲喂时各内参基因表达稳定性分析
        1.8 饥饿处理时各内参基因表达稳定性分析
        1.9 所有样品内参基因表达稳定性分析
    2 褐飞虱精氨酸激酶基因的克隆及其分子特性研究
        2.1 nlak基因克隆与分析
        2.2 昆虫杆状病毒表达系统表达褐飞虱精氨酸激酶重组蛋白
            2.2.1 重组pBavAK8-nlak质粒的构建
            2.2.2 重组Ac NPV-N1AK在昆虫杆状病毒系统中的表达
        2.3 nlak基因表达谱分析
            2.3.1 不同发育时期nlak基因的表达分析
            2.3.2 不同组织部位nlak基因的表达分析
            2.3.3 不同地理种群nlak基因的表达分析
            2.3.4 不同温度处理下nlak基因的表达分析
            2.3.5 不同药剂处理下nlak基因的表达分析
            2.3.6 不同食物处理下nlak基因的表达分析
            2.3.7 饥饿处理下nlak基因的表达分析
            2.3.8 不同发育时期褐飞虱精氨酸激酶的酶活性测定
            2.3.9 不同组织部位褐飞虱精氨酸激酶的酶活性测定
        2.4 nlak基因RNAi的分析
            2.4.1 dsRNA在人工饲料中的稳定性分析
            2.4.2 dsRNA使用浓度的确定
            2.4.3 nlak基因RNAi后对存活率的影响
            2.4.4 nlak基因RNAi后褐飞虱nlak基因表达量的变化
            2.4.5 nlak基因RNAi后酶活性测定
第四章 总结与讨论
    1 全文总结
    2 讨论
        2.1 褐飞虱内参基因筛选的研究
        2.2 褐飞虱nlak基因RNAi的研究
第五章 创新点
参考文献
附录 攻读博士学位期间发表文章
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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博士论文
[1]抗虫水稻对褐飞虱抗性研究及褐飞虱apterousA基因的功能研究[D]. 李洁.华中农业大学 2013
[2]对磷酸原激酶家族中精氨酸激酶与肌酸激酶抑制作用的研究[D]. 盛清.浙江大学 2009
[3]黄曲条跳甲关键功能基因的克隆及利用RNAi技术控制害虫[D]. 赵伊英.福建农林大学 2008

硕士论文
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[2]精氨酸激酶在棉铃虫中的表达及调控研究[D]. 苏晓峰.中国农业科学院 2011
[3]烟夜蛾气味受体基因和精氨酸激酶基因的克隆与表达分析[D]. 张元臣.河南农业大学 2011
[4]海参精氨酸激酶的反应半胱氨酸巯基的初步研究[D]. 赵峰.清华大学 2005



本文编号：3626303