昆虫病原线虫体外RNAi饲喂技术研究

发布时间：2022-09-29 18:45

　　昆虫病原线虫（Entomopathogenic nematode）的基因与模式线虫秀丽隐杆线虫Caenorhabdits elegans存在很高的同源性。然而,研究寄生线虫的基因功能仅靠借助C.elegans的研究结果远远不够,尤其是在阐明寄生虫与宿主之间的共生关系的机制方面。因此迫切需要建立昆虫病原线虫的功能基因研究技术。本研究以小卷蛾斯氏线虫为研究对象,利用大肠杆菌饲喂的方法对小卷蛾斯氏线虫che-11基因进行了 RNAI研究,为昆虫病原线虫基因功能研究提供了一种新的技术方法。本研究所取得的主要结论如下:（1）利用大肠杆菌HT115在90mm直径培养基上培养线虫时,线虫的最佳接种量为500IJ/皿,其接种代线虫恢复率为80%以上,培养20d线虫产量为4037IJ/皿,收获的侵染期线虫整齐度为92%以上。在NGM培养基中添加50 mg/L的Amp或0.4mM的IPTG或50 mg/L的Amp+0.4mM的IPTG,对线虫的繁殖无影响。（2）本研究通过分析其他线虫的che-11基因保守区序列,设计简并引物PCR扩增获得小卷蛾斯氏线虫che-11基因的同源片段,并将特异片段重组到L444... 

【文章页数】：46 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
第一章 前言
    1.1 昆虫病原线虫
        1.1.1 昆虫病原线虫的生物防治作用
        1.1.2 昆虫病原线虫生活史
        1.1.3 昆虫病原线虫的致病机理
        1.1.4 昆虫病原线虫及其共生菌的环境安全性
    1.2 寄生虫功能基因组学的研究进展
        1.2.1 差异表达基因的发现
        1.2.2 寄生虫的转基因技术
    1.3 RNAi在线虫研究中的应用
        1.3.1 RNAi的作用机制
        1.3.2 RNAi在模式线虫研究中的应用
        1.3.3 RNAi在非模式线虫研究中的应用
    1.4 研究思路、内容与技术路线
        1.4.1 研究思路
        1.4.2 技术路线
第二章 线虫的大肠杆菌培养法研究
    2.1 材料与方法
        2.1.1 供试菌株、质粒及材料
        2.1.2 培养基配制
        2.1.3 饲喂细菌的培养
        2.1.4 昆虫病原线虫的计数
        2.1.5 小卷蛾斯氏线虫的平板培养
        2.1.6 线虫接种量对平板培养线虫发育繁殖的影响
        2.1.7 细菌菌株对平板培养线虫发育繁殖的影响
        2.1.8 培养基中抗生素和诱导剂添加对平板培养线虫发育繁殖的影响
        2.1.9 数据处理
    2.2 结果与分析
        2.2.1 线虫初始接种量对接种代线虫发育的影响
        2.2.2 线虫初始接种量对线虫繁殖量的影响
        2.2.3 细菌菌株对接种代线虫发育的影响
        2.2.4 细菌菌株对接种代线虫繁殖量的影响
        2.2.5 添加物对接种代线虫发育的影响
        2.2.6 添加物对接种代线虫繁殖量的影响
第三章 che-11基因的RNAi表达菌株饲喂线虫法研究
    3.1 材料与方法
        3.1.1 相关试剂
        3.1.2 线虫总RNA的制备与纯化
        3.1.3 琼脂糖电泳检测
        3.1.4 RNA的反转录合成cDNA
        3.1.5 cRNA质控
        3.1.6 che-11简并引物设计合成
        3.1.7 目标基因的特异扩增
        3.1.8 目的基因特异片段的胶回收纯化
        3.1.9 目的基因特异片段的T载体连接
        3.1.10 CaCl_2法小量制备大肠杆菌DH5α感受态细胞
        3.1.11 目标基因片段的转化
        3.1.12 蓝白斑筛选及菌液PCR检测
        3.1.13 核酸测序
        3.1.14 线虫饲喂RNAi诱导载体的构建策略
        3.1.15 che-11目的片段的亚克隆
        3.1.16 靶标基因干扰载体构建
        3.1.17 靶标基因RNAI载体质粒提取
        3.1.18 靶标基因干扰载体转化RNAi表达菌株
        3.1.19 目标基因的RNAi效果验证
    3.2 结果与分析
        3.2.1 总RNA的分离
        3.2.2 che-11基因的同源克隆与测序
        3.2.3 靶标基因RNAi表达大肠杆菌菌株的获得
        3.2.4 干扰效果的验证
第四章 结论与讨论
    4.1 结论
    4.2 展望
参考文献
Abstract
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]捻转血矛线虫Hc38基因RNA干扰效果[J]. 荣光,赵军明,王新华,薄新文.  中国兽医杂志. 2009(05)
[2]昆虫病原线虫对东北大黑鳃金龟防治效果研究[J]. 许艳丽,钱秀娟,李春杰,刘长仲.  农业系统科学与综合研究. 2008(01)
[3]昆虫病原线虫发育相关基因的差异表达[J]. 夏颖伟,丘雪红,韩日畴.  中国生物防治. 2008(01)
[4]昆虫病原线虫感染寄主行为研究进展[J]. 李慧萍,韩日畴.  昆虫知识. 2007(05)
[5]昆虫病原线虫对花生田蛴螬的防治效果[J]. 李俊秀,孙春梅,康宇静,马骥.  农药. 2007(01)
[6]昆虫病原线虫共生细菌胞内晶体蛋白的研究进展[J]. 游娟,梁世中,韩日畴.  昆虫天敌. 2005(02)
[7]用昆虫病原线虫防治韭菜蛆[J]. 杨秀芬,简恒,杨怀文,刘峥,袁京京.  植物保护学报. 2004(01)
[8]昆虫病原线虫研究概况[J]. 董国伟,刘贤进,余向阳,董健.  昆虫知识. 2001(02)
[9]昆虫病原线虫共生细菌致病机理的研究进展[J]. 王立霞,杨怀文,黄大昉.  微生物学报. 2000(04)
[10]应用生物防治棉蝗及星天牛——沿海防护林木麻黄病虫害综合控制技术研究报告[J]. 刘清浪,陈瑞屏,吴若光,黄金水,丁泌,柯玉铸,陈炳铨,岑炳沾,张景宁.  昆虫天敌. 1999(03)



本文编号：3683114