dsRNA和重组TMV介导的针对玉米黏虫Chitinase基因的RNA干扰研究
发布时间：2022-10-20 11:08
RNAi （RNA interference, RNA干扰）是序列特异的基因沉默技术。RNAi在植物抗病领域得到了广泛的应用,2007年美国Monsanto公司及中国科学院研究人员利用RNAi技术分别获得了抗虫转基因玉米和棉花,为农业害虫的防控提供了新的思路和途径。玉米粘虫是属于鳞翅目夜蛾科的非常重要的农药害虫。近几年,玉米粘虫在我国华北地区爆发成灾,迫切需要探索有效的控制途径。本实验中挑选了对粘虫生长发育至关重要的chitinase基因做为候选基因,设计合成和检测了抑制chitinase基因的干扰RNA序列。为了达到RNAi效果,我们设计了两个实验。第一,体外合成针对靶基因的dsRNA,并与人工饲料混匀,饲喂玉米粘虫。第二,为了检测植物体内表达的dsRNA所介导的RNAi效应,本研究将干扰片段克隆到植物病毒载TMV （PJL36）,并将重组载体侵染了本氏烟草。TMV病毒的复制过程会产生相应插入序列对应的dsRNA,将其饲喂给玉米粘虫,以期在玉米粘虫体内产生针对靶基因的RNA干扰效应。随后,本研究通过测定以下指标来检测了上述两种方法介导的RNAi效应。荧光定量PCR结果表明,chiti...
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
英文缩写和中英文对照表
第一章 引言
1.1 RNAi的研究概况
1.1.1 RNAi的发现
1.1.2 RNAi的基本原理
1.1.3 RNAi过程相关酶
1.2 RNAi技术在植物抗虫基因工程中的应用
1.2.1 植物抗虫基因工程的研究
1.2.2 植物病毒载体在RNAi中的应用
1.3 RNAi在昆虫研究领域的应用
1.3.1 昆虫RNAi
1.3.2 利用RNAi控制农业害虫
1.3.3 dsRNA的摄取
1.3.4 dsRNA饲喂昆虫
1.4 研究目的及意义
第二章 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料及昆虫饲养
2.1.2 病毒载体及昆虫饲喂实验
2.1.3 人工饲料及配制
2.1.4 引物序列
2.2 实验方法
2.2.1 克隆及鉴定目的基因
2.2.2 TMV病毒表达载体的构建
2.2.3 农杆菌转化重组质粒
2.2.4 TMV重组质粒侵染本氏烟草
2.2.5 本氏烟草饲喂玉米粘虫
2.2.6 dsRNA合成及玉米粘虫饲喂实验
2.2.7 RT-PCR检测基因沉默效率
2.2.8 地高辛标记(DIG)的Northern杂交分析
第三章 结果与分析
3.1 干扰基因片段的克隆
3.1.1 靶标基因的PCR扩增
3.1.2 pGM-T重组质粒的筛选
3.1.3 酶切检测pGM-T重组质粒
3.2 重组病毒表达载体的构建
3.2.1 TMV重组质粒的筛选
3.2.2 TMV重组质粒的酶切鉴定
3.3 农杆菌转化子的筛选
3.3.1 PCR检测农杆菌转化子
3.4 dsRNA的制备和检测
3.5 饲喂玉米黏虫
3.6 受试玉米黏虫的体重及死亡率统计
3.6.1 本氏烟草饲喂后的玉米黏虫的体重变化
3.6.2 本氏烟草饲喂后的玉米黏虫的死亡率统计
3.6.3 dsRNA饲喂后的玉米黏虫的体重变化
3.6.4 dsRNA饲喂后的玉米黏虫死亡率统计
3.7 受试玉米黏虫的表型变化
3.8 受试昆虫靶标基因表达量的检测
3.8.1 chitinase1基因表达量的变化
3.8.2 chitinase2基因表达量的变化
3.9 受试玉米黏虫体内靶标基因对应的siRNA的检测
第四章 讨论与结论
4.1 讨论
4.2 结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物抗虫基因工程的研究[J]. 杨俊杰,于惠敏,张海龙. 山东教育学院学报. 2008(03)
博士论文
[1]RNAi介导的棉铃虫HaHR3基因沉默及转基因植物抗虫机理研究[D]. 熊叶辉.中国农业科学院 2013
硕士论文
[1]斑马鱼chitinase-3基因的功能分析及其在早期胚胎免疫中的作用[D]. 滕子楠.中国海洋大学 2014
本文编号：3694378
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
英文缩写和中英文对照表
第一章 引言
1.1 RNAi的研究概况
1.1.1 RNAi的发现
1.1.2 RNAi的基本原理
1.1.3 RNAi过程相关酶
1.2 RNAi技术在植物抗虫基因工程中的应用
1.2.1 植物抗虫基因工程的研究
1.2.2 植物病毒载体在RNAi中的应用
1.3 RNAi在昆虫研究领域的应用
1.3.1 昆虫RNAi
1.3.2 利用RNAi控制农业害虫
1.3.3 dsRNA的摄取
1.3.4 dsRNA饲喂昆虫
1.4 研究目的及意义
第二章 实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料及昆虫饲养
2.1.2 病毒载体及昆虫饲喂实验
2.1.3 人工饲料及配制
2.1.4 引物序列
2.2 实验方法
2.2.1 克隆及鉴定目的基因
2.2.2 TMV病毒表达载体的构建
2.2.3 农杆菌转化重组质粒
2.2.4 TMV重组质粒侵染本氏烟草
2.2.5 本氏烟草饲喂玉米粘虫
2.2.6 dsRNA合成及玉米粘虫饲喂实验
2.2.7 RT-PCR检测基因沉默效率
2.2.8 地高辛标记(DIG)的Northern杂交分析
第三章 结果与分析
3.1 干扰基因片段的克隆
3.1.1 靶标基因的PCR扩增
3.1.2 pGM-T重组质粒的筛选
3.1.3 酶切检测pGM-T重组质粒
3.2 重组病毒表达载体的构建
3.2.1 TMV重组质粒的筛选
3.2.2 TMV重组质粒的酶切鉴定
3.3 农杆菌转化子的筛选
3.3.1 PCR检测农杆菌转化子
3.4 dsRNA的制备和检测
3.5 饲喂玉米黏虫
3.6 受试玉米黏虫的体重及死亡率统计
3.6.1 本氏烟草饲喂后的玉米黏虫的体重变化
3.6.2 本氏烟草饲喂后的玉米黏虫的死亡率统计
3.6.3 dsRNA饲喂后的玉米黏虫的体重变化
3.6.4 dsRNA饲喂后的玉米黏虫死亡率统计
3.7 受试玉米黏虫的表型变化
3.8 受试昆虫靶标基因表达量的检测
3.8.1 chitinase1基因表达量的变化
3.8.2 chitinase2基因表达量的变化
3.9 受试玉米黏虫体内靶标基因对应的siRNA的检测
第四章 讨论与结论
4.1 讨论
4.2 结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物抗虫基因工程的研究[J]. 杨俊杰,于惠敏,张海龙. 山东教育学院学报. 2008(03)
博士论文
[1]RNAi介导的棉铃虫HaHR3基因沉默及转基因植物抗虫机理研究[D]. 熊叶辉.中国农业科学院 2013
硕士论文
[1]斑马鱼chitinase-3基因的功能分析及其在早期胚胎免疫中的作用[D]. 滕子楠.中国海洋大学 2014
本文编号：3694378
本文链接：https://www.wllwen.com/kejilunwen/nykj/3694378.html
