麦二叉蚜唾液蛋白C002的基因克隆与RNA干扰研究
发布时间：2023-02-09 10:05
蚜虫为农业重大害虫之一,属是刺吸式害虫,可通过直接刺吸植株汁液及间接传播病毒病对植物造成严重危害。已有报道蚜虫唾液在蚜虫-寄主植株互作关系中起到非常重要的作用,如形成口针鞘保护蚜虫口针以协助蚜虫穿刺,帮助蚜虫消化营养物质,诱导或抑制植株的防御反应,参与病毒传播等。蚜虫唾液相关蛋白C002是一种水溶性唾液蛋白,已被证实参与蚜虫的取食过程,是蚜虫取食必需蛋白,但其作用机理仍未知。随着RNAi技术的发展,在害虫靶标基因功能的研究中广泛应用。因此,开展麦蚜C002蛋白基因克隆,并利用RNAi技术进行缺失功能验证,为解析其在蚜虫-寄主植物互作中作用机理奠定基础。 本研究利用RT-PCR及RACE技术扩增麦二叉蚜Schizaphis graminum的唾液相关蛋白C002的cDNA序列全长；运用Real-time PCR研究了该基因的时空表达谱；通过RNAi技术抑制C002基因的表达,利用Real-time PCR技术检测沉默效率；分析该基因沉默后对麦二叉蚜存活率的影响。取得如下研究结果： 首次克隆了麦二叉蚜唾液相关蛋白C002的cDNA全长序列。根据已报道的不同种蚜虫C002蛋白的氨基酸保守区域...
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 引言
1.1 蚜虫唾液及其在蚜虫-寄主植株互作关系的作用
1.1.1 凝胶唾液与水溶性唾液
1.1.2 蚜虫唾液蛋白C002研究进展
1.2 实时荧光定量PCR
1.2.1 实时荧光定量PCR技术原理
1.2.2 实时荧光定量PCR技术类型
1.2.3 实时荧光定量PCR技术在昆虫学中的应用
1.3 RNA干扰技术研究概况
1.3.1 RNAi的分子机制
1.3.2 昆虫dsRNA的内吸机制研究
1.3.3 昆虫RNAi效率影响因素
1.3.4 昆虫RNAi技术的应用前景
1.4 本研究的目的与意义
第二章 麦二叉蚜唾液蛋白C002的基因克隆
2.1 材料
2.1.1 供试昆虫
2.1.2 培养基配制
2.1.3 主要试剂
2.1.4 仪器设备
2.2 方法
2.2.1 技术路线
2.2.2 总RNA的提取
2.2.3 第一条cDNA链的合成
2.2.4 扩增麦二叉蚜C002基因的引物
2.2.5 RT-PCR反应体系
2.2.6 C002 5’-RACE
2.2.7 C002 3’-RACE
2.2.8 PCR产物的胶回收纯化
2.2.9 连接与转化
2.2.10 菌落PCR鉴定阳性克隆
2.2.11 质粒DNA的小量提取
2.2.12 序列测定
2.3 结果与分析
2.3.1 麦二叉蚜唾液蛋白C002基因特异性片段扩增
2.3.2 麦二叉蚜唾液蛋白C002 3’5'-RACE结果
2.3.3 目的基因开放阅读框(ORF)全长的获取与验证
2.3.4 目的基因氨基酸序列比对结果
2.3.5 氨基酸性质预测
2.4 结论与讨论
第三章 麦二叉蚜唾液蛋白C002基因的时空表达谱分析
3.1 材料
3.1.1 供试昆虫
3.1.2 主要试剂
3.1.3 仪器设备
3.2 方法
3.2.1 总RNA的提取
3.2.2 第一条cDNA链的合成
3.2.3 扩增麦二叉蚜C002片段及内参基因的引物
3.2.4 RT-PCR反应体系
3.2.5 PCR产物的胶回收纯化
3.2.6 连接与转化
3.2.7 菌落PCR鉴定阳性克隆
3.2.8 质粒DNA的小量提取
3.2.9 序列测定
3.2.10 荧光定量PCR
3.2.11 标准曲线构建
3.3 结果与分析
3.3.1 RNA质量检测
3.3.2 引物筛选
3.3.3 上机检测引物特异性
3.3.4 标准曲线的构建
3.3.5 SgC002在麦二叉蚜不同组织中的相对表达量
3.3.6 SgC002在麦二叉蚜不同龄期中的相对表达量
3.3.7 SgC002在麦二叉蚜不同蚜型中的相对表达量
3.4 结论与讨论
第四章 麦二叉蚜唾液蛋白C002的RNA干扰研究
4.1 材料
4.1.1 供试昆虫
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要仪器设备
4.2 方法
4.2.1 麦二叉蚜人工饲料的配制与饲蚜器的制备
4.2.2 siRNA的设计与合成
4.2.3 siRNA的饲喂方法
4.2.4 半定量PCR检测沉默效率
4.2.5 荧光定量PCR检测沉默效率
4.2.6 基因沉默后对麦二叉蚜存活率的影响
4.2.7 数据统计分析
4.3 结果与分析
4.3.1 siRNA的稳定性检测
4.3.2 半定量PCR检测饲喂siRNA后SgC002相对表达量变化
4.3.3 荧光定量PCR检测siRNA沉默效率
4.3.4 SgC002基因沉默后对麦二叉蚜存活率的影响
4.4 结论与讨论
第五章 结论
参考文献
致谢
作者简介
本文编号：3738694
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【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 引言
1.1 蚜虫唾液及其在蚜虫-寄主植株互作关系的作用
1.1.1 凝胶唾液与水溶性唾液
1.1.2 蚜虫唾液蛋白C002研究进展
1.2 实时荧光定量PCR
1.2.1 实时荧光定量PCR技术原理
1.2.2 实时荧光定量PCR技术类型
1.2.3 实时荧光定量PCR技术在昆虫学中的应用
1.3 RNA干扰技术研究概况
1.3.1 RNAi的分子机制
1.3.2 昆虫dsRNA的内吸机制研究
1.3.3 昆虫RNAi效率影响因素
1.3.4 昆虫RNAi技术的应用前景
1.4 本研究的目的与意义
第二章 麦二叉蚜唾液蛋白C002的基因克隆
2.1 材料
2.1.1 供试昆虫
2.1.2 培养基配制
2.1.3 主要试剂
2.1.4 仪器设备
2.2 方法
2.2.1 技术路线
2.2.2 总RNA的提取
2.2.3 第一条cDNA链的合成
2.2.4 扩增麦二叉蚜C002基因的引物
2.2.5 RT-PCR反应体系
2.2.6 C002 5’-RACE
2.2.7 C002 3’-RACE
2.2.8 PCR产物的胶回收纯化
2.2.9 连接与转化
2.2.10 菌落PCR鉴定阳性克隆
2.2.11 质粒DNA的小量提取
2.2.12 序列测定
2.3 结果与分析
2.3.1 麦二叉蚜唾液蛋白C002基因特异性片段扩增
2.3.2 麦二叉蚜唾液蛋白C002 3’5'-RACE结果
2.3.3 目的基因开放阅读框(ORF)全长的获取与验证
2.3.4 目的基因氨基酸序列比对结果
2.3.5 氨基酸性质预测
2.4 结论与讨论
第三章 麦二叉蚜唾液蛋白C002基因的时空表达谱分析
3.1 材料
3.1.1 供试昆虫
3.1.2 主要试剂
3.1.3 仪器设备
3.2 方法
3.2.1 总RNA的提取
3.2.2 第一条cDNA链的合成
3.2.3 扩增麦二叉蚜C002片段及内参基因的引物
3.2.4 RT-PCR反应体系
3.2.5 PCR产物的胶回收纯化
3.2.6 连接与转化
3.2.7 菌落PCR鉴定阳性克隆
3.2.8 质粒DNA的小量提取
3.2.9 序列测定
3.2.10 荧光定量PCR
3.2.11 标准曲线构建
3.3 结果与分析
3.3.1 RNA质量检测
3.3.2 引物筛选
3.3.3 上机检测引物特异性
3.3.4 标准曲线的构建
3.3.5 SgC002在麦二叉蚜不同组织中的相对表达量
3.3.6 SgC002在麦二叉蚜不同龄期中的相对表达量
3.3.7 SgC002在麦二叉蚜不同蚜型中的相对表达量
3.4 结论与讨论
第四章 麦二叉蚜唾液蛋白C002的RNA干扰研究
4.1 材料
4.1.1 供试昆虫
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要仪器设备
4.2 方法
4.2.1 麦二叉蚜人工饲料的配制与饲蚜器的制备
4.2.2 siRNA的设计与合成
4.2.3 siRNA的饲喂方法
4.2.4 半定量PCR检测沉默效率
4.2.5 荧光定量PCR检测沉默效率
4.2.6 基因沉默后对麦二叉蚜存活率的影响
4.2.7 数据统计分析
4.3 结果与分析
4.3.1 siRNA的稳定性检测
4.3.2 半定量PCR检测饲喂siRNA后SgC002相对表达量变化
4.3.3 荧光定量PCR检测siRNA沉默效率
4.3.4 SgC002基因沉默后对麦二叉蚜存活率的影响
4.4 结论与讨论
第五章 结论
参考文献
致谢
作者简介
本文编号：3738694
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