橘小实蝇rpl19 dsRNA对橘园非靶标昆虫干扰效应研究

发布时间：2023-02-21 17:59

　　RNAi是由双链RNA所引起的特异性基因沉默。喂食dsRNA达到RNAi效应在很多昆虫上取得成功,在害虫防治上表现出广泛的应用潜力,但是目前缺乏对于RNAi的安全性评价,因此评价RNAi包括对天敌和益虫等非靶标昆虫的干扰效应在内的环境安全性具有非常重要的意义。 本研究选取橘小实蝇Bactrocera dorsalis作为靶标昆虫,rpl19基因作为靶标基因,选择近缘种柑橘大实蝇Bactrocera minax,天敌长尾潜蝇茧蜂Diachasmimorpha longicaudata,益虫意大利蜜蜂?pis mellifera作为非靶标生物,同时喂食小实蝇rpl19基因不同片段的dsRNA,利用Real-time PCR等分子生物学技术检测各个昆虫rpl19的表达情况,研究昆虫dsRNA对非靶标昆虫的干扰效应,为RNAi用于害虫防治提供安全性评价的参考依据。主要研究结果如下： 1.成功克隆了橘小实蝇、柑橘大实蝇、长尾潜蝇茧蜂和意大利蜜蜂rpl19基因cDNA全长。基因同源性分析结果显示橘小实蝇rpH9基因ORF区域核酸序列与柑橘大实蝇同源性高达93%,与长尾潜蝇茧蜂同源性达72%,与意大...

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【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1 RNAi
    2 RNA干扰技术在昆虫中的应用
        2.1 dsRNA导入昆虫的方法
        2.2 昆虫对RNAi的敏感度
        2.3 RNAi在昆虫基因功能中研究现状
        2.4 RNAi在害虫防治中的研究进展
    3 Rpl19基因的功能研究
    4 橘小实蝇防治研究现状
    5 橘园昆虫群落研究
    6 本研究内容与目的意义
        6.1 研究内容与目的意义
        6.2 技术路线
第二章 柑橘大实蝇、意大利蜜蜂、长尾潜蝇茧蜂rpl19基因全长克隆
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 供试昆虫
            1.1.2 常用缓冲液、培养基及抗生素的配制
            1.1.3 主要试剂及试剂盒
            1.1.4 主要实验仪器设备
        1.2 实验方法
            1.2.1 总RNA的提取
            1.2.2 简并引物扩增柑橘大实蝇、长尾潜蝇茧蜂rpl19基因片段及基因克隆
            1.2.3 RACE扩增柑橘大实蝇、长尾潜蝇茧蜂、意大利蜜蜂3'端
            1.2.4 RACE扩增柑橘大实蝇、长尾潜蝇茧蜂、意大利蜜蜂5'端
    2 结果与分析
        2.1 总RNA的提取
        2.2 RT-PCR扩增相关基因片段
        2.3 PCR产物的的克隆与测序
            2.3.1 目标条带的回收及重组质粒的筛选
            2.3.2 序列结果与分析
        2.4 rpl19基因全长克隆
            2.4.1 3'RACE扩增结果
            2.4.2 3'RACE PCR产物的的克隆与测序
            2.4.3 5'RACE扩增结果
            2.4.4 5'RACE PCR产物的的克隆
            2.4.5 序列结果与分析
        2.5 rpl19基因同源性比对
            2.5.1 rpl19基因ORF区域核酸同源性比对
            2.5.2 rpl19基因氨基酸同源性比对
    3 小结
第三章 橘小实蝇rpl19 dsRNA对非靶标昆虫的RNAi效应研究
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 供试昆虫
            1.1.2 主要仪器设备
            1.1.3 常用缓冲液、培养基及抗生素的配制
            1.1.4 菌株和质粒
            1.1.5 主要试剂及试剂盒
        1.2 实验方法
            1.2.1 特异性引物的设计与合成
            1.2.2 目的片段的扩增
            1.2.3 质粒L4440及PCR产物双酶切反应
            1.2.4 质粒L4440与外源基因片段的连接
            1.2.5 连接产物的转化
            1.2.6 表达载体的筛选与鉴定
            1.2.7 dsRNA的表达
            1.2.8 RNAi干扰效应检测
            1.2.9 数据分析
    2 结果与分析
        2.1 dsRNA表达效果检测
        2.2 dsRNA摄入效果检测
        2.3 喂食Bdrpl19 CDS dsRNA、Bdrpl19 3'UTR后橘小实蝇rpl19表达量
        2.4 喂食Bmrpl19 CDS dsRNA、Bdrpl19 CDS dsRNA、Bdrpl19 3'UTR后柑橘大实蝇rpl19表达量
        2.5 喂食Dlrpl19 CDS dsRNA、Bdrpl19 CDS dsRNA、Bdrpl19 3'UTR后长尾潜蝇茧蜂rpl19表达量
        2.6 喂食Amrpl19 CDS dsRNA、Bdrpl19 CDS dsRNA、Bdrpl19 3'UTR后意大利蜜蜂rpl19表达量
    3 讨论
第四章 结论与展望
参考文献
致谢



本文编号：3747742