金钗石斛根际土壤细菌和放线菌分离及抑菌活性研究

发布时间：2017-05-18 16:27

  本文关键词：金钗石斛根际土壤细菌和放线菌分离及抑菌活性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：植物根际土壤存在大量微生物。植物通过其根系产生分泌物,向其周围土壤中的微生物提供物质能量和营养,影响根际微生物的群落结构,改变其生物活性。随着菌种分离、产物检测和结构鉴定新技术的发展,研究根际微生物及其代谢产物已成为寻找新抗生素和生物活性化合物的重要途径。金钗石斛为兰科石斛属植物,含有生物碱、倍半萜和联苄等多种化学成分,具抗肿瘤、抗氧化和抗白内障等生物活性。本研究是对金钗石斛根际土壤中细菌和放线菌进行分离,筛选具抑菌活性的菌株,分析可培养细菌、放线菌及具抑菌活性细菌、放线菌的多样性,并对一株具广谱抑菌活性的放线菌G29的发酵条件及其抑菌活性物质进行初步研究。具体研究结果如下:1.采用稀释平板法分离,从金钗石斛根际土壤中分离得到604株细菌和164株放线菌。基于16S r RNA基因序列分析表明,金钗石斛根际土壤细菌共分为3个类群,即厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes),包括16个属,其中厚壁菌门(Firmicutes)包括Bacillus、Lysinibacillus、Paenibacillus、Psychrobacillus等4个属;变形菌门(Proteobacteria)包括Burkholderia、Comamonas、Serratia、Rahnella、Pseudomonas、Acinetobacter、Aeromonas、Leclercia等8个属;拟杆菌门包括Chryseobacterium、Elizabethkingia、Sphingobacterium、Chitinophaga等4个属。Bacillus为优势菌群。金钗石斛根际土壤中分离的菌株在系统发育关系上为放线菌门(Actinobacteria),包括2个属,即Streptomyces和Cellulosimicrobium。其中,Streptomyces为优势菌群。2.通过双层平板打孔法筛选,分别获得具有抑菌活性的34株细菌和19株放线菌,具有抑菌活性的细菌为Bacillus、Pseudomonas、Aeromonas、Psychrobacillus、Leclercia。具有抑菌活性的放线菌为Streptomyces。3.放线菌G29为一株具广谱抑菌活性菌株,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白菜软腐病菌、白色念珠菌、瓜果腐霉、马铃薯晚疫病菌都具有抑菌活性。通过形态观察、生理生化测定及16S rRNA基因序列分析,初步鉴定为Streptomyces costaricanus。通过发酵基础培养基的筛选、单因子试验、Plackett Burman试验设计、最陡爬坡法、响应面法等对G29的发酵培养基和发酵条件进行优化,获得发酵培养的最佳条件:可溶性淀粉4.00 g/L、麦芽浸粉11.27 g/L、酵母浸粉5.83 g/L、CaCO3 3.09 g/L、蒸馏水1000 mL;接种量为5%,初始值6.5,发酵时间为120 h,培养温度28°C,摇瓶转速160 r/min,装液量100 mL/300 mL。4.采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取根际土壤放线菌G29发酵产物的活性成分,其中,乙酸乙酯萃取组分抑菌活性显著,薄层层析、硅胶柱层析及HPLC对乙酸乙酯萃取组分活性物质进行活性跟踪分离纯化,初步得到3个具有抑菌活性的化合物。其中化合物G-1纯度达99.17%,HPLC-GC初步确定化合物G-1分子量为997。
【关键词】：根际土壤 链霉菌 抑菌活性 多样性 发酵条件 分离纯化
【学位授予单位】：贵州师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S567.239;S154.39
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 第1章 文献综述9-17
• 1.1 根际土壤微生物9
• 1.1.1 根际及根际土壤微生物9
• 1.1.2 植物-根际土壤微生物相互作用9
• 1.2 植物根际土壤细菌和放线菌的多样性9-10
• 1.2.1 植物根际土壤细菌多样性9-10
• 1.2.2 植物根际土壤放线菌多样性10
• 1.3 土壤微生物多样性研究方法10-13
• 1.3.1 传统纯培养方法11
• 1.3.2 Biolog法11-12
• 1.3.3 磷脂脂肪酸法12
• 1.3.4 分子生物学方法12-13
• 1.4 生防细菌和放线菌的研究13-14
• 1.4.1 生防细菌13
• 1.4.2 生防放线菌13-14
• 1.5 土壤细菌和放线菌次级代谢产物研究14-15
• 1.5.1 土壤细菌次级代谢产物研究14
• 1.5.2 土壤放线菌次级代谢产物研究14-15
• 1.6 研究目的及意义15-16
• 1.7 研究技术路线16-17
• 第2章 金钗石斛根际土壤可培养细菌及放线菌多样性17-27
• 2.1 材料17-18
• 2.1.1 样品采集17
• 2.1.2 培养基17-18
• 2.1.3 试剂18
• 2.1.4 仪器18
• 2.2 方法18-19
• 2.2.1 根际土壤细菌和放线菌的分离纯化18
• 2.2.2 根际土壤细菌和放线菌的分子鉴定18-19
• 2.3 结果与分析19-24
• 2.3.1 金钗石斛根际土壤细菌和放线菌的分离19-20
• 2.3.2 金钗石斛根际可培养细菌的鉴定20-23
• 2.3.3 金钗石斛根际可培养放线菌的鉴定23-24
• 2.4 讨论24-25
• 2.5 小结25-27
• 第3章 根际土壤细菌及放线菌抑菌活性的筛选27-36
• 3.1 材料27-28
• 3.1.1 测试菌株27
• 3.1.2 指示菌27
• 3.1.3 培养基27-28
• 3.1.4 试剂28
• 3.1.5 仪器28
• 3.2 方法28-29
• 3.2.1 发酵上清液的制备28
• 3.2.2 指示菌的活化培养28-29
• 3.2.3 具抑菌活性根际土壤细菌和放线菌的筛选29
• 3.3 结果与分析29-34
• 3.3.1 具抑菌活性根际土壤细菌的筛选29-31
• 3.3.2 具抑菌活性根际土壤放线菌的筛选31-33
• 3.3.3 具抑菌活性细菌和放线菌的初步鉴定33-34
• 3.4 讨论34-35
• 3.5 小结35-36
• 第4章 根际土壤放线菌G29的鉴定及其发酵条件的优化36-54
• 4.1 材料36-37
• 4.1.1 菌株36
• 4.1.2 培养基36
• 4.1.3 试剂36-37
• 4.1.4 仪器37
• 4.2 方法37-39
• 4.2.1 根际土壤放线菌的鉴定37
• 4.2.2 抑菌活性的测定37
• 4.2.3 发酵条件的优化37-39
• 4.2.4 优化条件的验证39
• 4.3 结果与分析39-51
• 4.3.1 根际土壤放线菌G29的鉴定39-41
• 4.3.2 土壤放线菌G29发酵液的抑菌活性41
• 4.3.3 发酵条件的优化41-47
• 4.3.4 Plackett-Burman试验设计47-48
• 4.3.5 最陡爬坡试验48
• 4.3.6 Box-Behnken试验设计48-51
• 4.4 讨论51-53
• 4.5 小结53-54
• 4.5.1 放线菌G29的鉴定53
• 4.5.2 放线菌G29发酵条件优化53-54
• 第5章 根际土壤放线菌G29抑菌活性物质的初步研究54-61
• 5.1 材料54-55
• 5.1.1 菌株54
• 5.1.2 培养基54
• 5.1.3 试剂54
• 5.1.4 仪器54-55
• 5.2 方法55-56
• 5.2.1 土壤放线菌G29发酵上清液的制备55
• 5.2.2 抑菌活性的测定55
• 5.2.3 土壤放线菌G29抑菌活性物质的分离纯化55-56
• 5.3 结果与分析56-59
• 5.3.1 根际土壤放线菌G29发酵产物中抑菌活性成分的极性分析56-57
• 5.3.2 薄层层析展开剂的选择57
• 5.3.3 抑菌活性物质的分离57-59
• 5.3.4 抑菌活性物质G-1 的纯化及分子量测定59
• 5.4 讨论59-60
• 5.5 小结60-61
• 5.5.1 放线菌G29发酵产物中抑菌活性成分的极性分析60
• 5.5.2 放线菌G29发酵产物抑菌活性物质初步分离纯化60-61
• 参考文献61-71
• 致谢71-72
• 附录72-74
• 攻读硕士研究生期间发表的学术论文74-75

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