象耳豆根结线虫MeActin基因的克隆及MeHsp70基因的克隆与原核表达
发布时间：2023-04-05 01:44
根结线虫(Meloidogyne spp.)为植物根系内寄生物,可对农作物造成严重的危害。在国内已报道30多种根结线虫中,象耳豆根结线虫(M. enterolobii Yang and Eisenback,1983)在海南岛已普遍分布,广东省也有发现。通过海南岛瓜类蔬菜、茄果类蔬菜和南药植物根结线虫种类鉴定,发现该种群已进一步扩散,正在显示出取代南方根结线虫Meloidogyne incognita,而成为我国热带亚热带地区最重要根结线虫种类的趋势。近年来对该线虫的研究备受关注,但对于其功能基因及功能基因组等分子生物学研究报道很少。本研究以该线虫为材料,在逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)结合cDNA末端快速扩增(RACE)技术的基础上,克隆得到M. enterolobii的Actin基因和Hsp70基因全长cDNA序列,并对其进行了生物信息学分析以及MeHsp70原核表达分析。主要研究结果如下： (1) MeActin基因全长cDNA序列为1298bp,包含一个全长1125bp的开放阅读框ORF,编码375个氨基酸,起始密码子在82位,终止密码子在1207位(GenBank登录号K...
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1 引言
1.1 象耳豆根结线虫研究进展
1.2 肌动蛋白简介
1.3 植物寄生线虫Hsp70研究进展
1.3.1 Hsp70家族的分类
1.3.2 Hsp70的结构及其生物学功能
1.3.3 植物寄生线虫Hsp70的研究
1.3.4 展望
1.4 研究目的与意义
1.5 研究的技术路线
2 材料与方法
2.1 供试线虫
2.2 主要试剂与仪器
2.3 主要试剂及培养基配制
2.4 象耳豆根结线虫种群的纯化与培养
2.4.1 象耳豆根结线虫的鉴定
2.4.2 象耳豆根结线虫的培养
2.4.3 象耳豆根结线虫J2的获得
2.5 总RNA的提取
2.5.1 TRIzon提取法
2.5.2 试剂盒提取法(动物组织总RNA提取试剂盒)
2.6 cDNA的合成
2.6.1 无RNase的DNase处理
2.6.2 第一链cDNA的合成
2.7 象耳豆根结线虫Actin和Hsp70基因核心序列的克隆
2.7.1 Hsp70简并引物的设计与合成
2.7.2 象耳豆根结线虫Actin基因中间片段的克隆
2.7.3 象耳豆根结线虫Hsp70基因中间片段的克隆
2.7.4 目的片段的回收
2.7.5 目的片段与T-载体的连接
2.7.6 质粒转化
2.7.7 阳性克隆的鉴定
2.7.8 重组质粒的测序及分析
2.8 RACE法获得象耳豆根结线虫Actin和Hsp70基因全长cDNA
2.8.1 3’和5’RACE cDNA第一链的合成
2.8.2 象耳豆根结线虫Actin和Hsp70基因3'RACE
2.8.3 象耳豆根结线虫Actin和Hsp70基因5'RACE
2.9 象耳豆根结线虫Actin cDNA和Hsp70 cDNA全长序列的确定
2.10 生物信息学分析
2.11 象耳豆根结线虫Hsp70的原核表达
2.11.1 象耳豆根结线虫Hsp70原核表达载体的构建
2.11.2 Hsp70在BL21(DE3)中的诱导表达及蛋白样品的制备
2.11.3 表达产物的SDS-PAGE电泳检测
2.12 转化菌株的高温胁迫处理
3 结果与分析
3.1 象耳豆根结线虫的鉴定
3.2 RNA的质量分析
3.3 象耳豆根结线虫Actin和Hsp70基因的克隆与序列分析
3.3.1 象耳豆根结线虫Actin和Hsp70基因中间片段cDNA序列的克隆
3.3.2 象耳豆根结线虫Actin和Hsp70基因3'RACE克隆与序列分析
3.3.3 象耳豆根结线虫Actin和Hsp70基因5'RACE克隆与序列分析
3.3.4 象耳豆根结线虫Actin cDNA和Hsp70 cDNA全长序列的确定
3.3.5 象耳豆根结线虫Actin和Hsp70序列分析和同源性比较
3.3.6 象耳豆根结线虫Actin和Hsp70进化分析
3.3.7 象耳豆根结线虫Hsp70蛋白结构和功能的预测
3.4 pEASY-E1-MeHsp70、pET30-MeHsp70表达载体的构建及目的蛋白的诱导表达
3.4.1 重组质粒pEASY-E1-MeHsp70构建结果
3.4.2 重组质粒pET30-MeHsp70的构建结果
3.4.3 重组质粒pEASY-E1-MeHsp70、pET30a-MeHsp70转化受体细菌转化子的筛选
3.4.4 Hsp70的表达
3.5 异源表达Hsp70基因提高大肠杆菌的耐热力
4 讨论
4.1 M. enterolobii Actin
4.2 M. enterolobii Hsp70
5 结论
5.1 M. enterolobii Actin
5.2 M. enterolobii Hsp70
6 有待进一步研究之处
参考文献
缩略表
致谢
本文编号：3782475
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1 引言
1.1 象耳豆根结线虫研究进展
1.2 肌动蛋白简介
1.3 植物寄生线虫Hsp70研究进展
1.3.1 Hsp70家族的分类
1.3.2 Hsp70的结构及其生物学功能
1.3.3 植物寄生线虫Hsp70的研究
1.3.4 展望
1.4 研究目的与意义
1.5 研究的技术路线
2 材料与方法
2.1 供试线虫
2.2 主要试剂与仪器
2.3 主要试剂及培养基配制
2.4 象耳豆根结线虫种群的纯化与培养
2.4.1 象耳豆根结线虫的鉴定
2.4.2 象耳豆根结线虫的培养
2.4.3 象耳豆根结线虫J2的获得
2.5 总RNA的提取
2.5.1 TRIzon提取法
2.5.2 试剂盒提取法(动物组织总RNA提取试剂盒)
2.6 cDNA的合成
2.6.1 无RNase的DNase处理
2.6.2 第一链cDNA的合成
2.7 象耳豆根结线虫Actin和Hsp70基因核心序列的克隆
2.7.1 Hsp70简并引物的设计与合成
2.7.2 象耳豆根结线虫Actin基因中间片段的克隆
2.7.3 象耳豆根结线虫Hsp70基因中间片段的克隆
2.7.4 目的片段的回收
2.7.5 目的片段与T-载体的连接
2.7.6 质粒转化
2.7.7 阳性克隆的鉴定
2.7.8 重组质粒的测序及分析
2.8 RACE法获得象耳豆根结线虫Actin和Hsp70基因全长cDNA
2.8.1 3’和5’RACE cDNA第一链的合成
2.8.2 象耳豆根结线虫Actin和Hsp70基因3'RACE
2.8.3 象耳豆根结线虫Actin和Hsp70基因5'RACE
2.9 象耳豆根结线虫Actin cDNA和Hsp70 cDNA全长序列的确定
2.10 生物信息学分析
2.11 象耳豆根结线虫Hsp70的原核表达
2.11.1 象耳豆根结线虫Hsp70原核表达载体的构建
2.11.2 Hsp70在BL21(DE3)中的诱导表达及蛋白样品的制备
2.11.3 表达产物的SDS-PAGE电泳检测
2.12 转化菌株的高温胁迫处理
3 结果与分析
3.1 象耳豆根结线虫的鉴定
3.2 RNA的质量分析
3.3 象耳豆根结线虫Actin和Hsp70基因的克隆与序列分析
3.3.1 象耳豆根结线虫Actin和Hsp70基因中间片段cDNA序列的克隆
3.3.2 象耳豆根结线虫Actin和Hsp70基因3'RACE克隆与序列分析
3.3.3 象耳豆根结线虫Actin和Hsp70基因5'RACE克隆与序列分析
3.3.4 象耳豆根结线虫Actin cDNA和Hsp70 cDNA全长序列的确定
3.3.5 象耳豆根结线虫Actin和Hsp70序列分析和同源性比较
3.3.6 象耳豆根结线虫Actin和Hsp70进化分析
3.3.7 象耳豆根结线虫Hsp70蛋白结构和功能的预测
3.4 pEASY-E1-MeHsp70、pET30-MeHsp70表达载体的构建及目的蛋白的诱导表达
3.4.1 重组质粒pEASY-E1-MeHsp70构建结果
3.4.2 重组质粒pET30-MeHsp70的构建结果
3.4.3 重组质粒pEASY-E1-MeHsp70、pET30a-MeHsp70转化受体细菌转化子的筛选
3.4.4 Hsp70的表达
3.5 异源表达Hsp70基因提高大肠杆菌的耐热力
4 讨论
4.1 M. enterolobii Actin
4.2 M. enterolobii Hsp70
5 结论
5.1 M. enterolobii Actin
5.2 M. enterolobii Hsp70
6 有待进一步研究之处
参考文献
缩略表
致谢
本文编号：3782475
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