罗伯茨绿僵菌的CRISPR/Cas9基因组编辑系统建立的初步探究

发布时间：2023-04-05 04:06

　　昆虫病原真菌是指寄生于昆虫并引起昆虫死亡的一类真菌,由于其对害虫致病性强、在害虫个体间传播速度快、对环境友好性高等特点而被广泛应用于农业生产中的病虫害防治。罗伯茨绿僵菌是一种广谱杀虫真菌,它的致病力强,对农作物无害且容易大规模生产。但是对于罗伯茨绿僵菌的遗传改造一直受到其同源重组效率过低因素的限制。而以锌指核酸酶和TALEN为代表的核酸内切酶虽然可以达到进行基因组编辑的目的,但其成本过高,操作流程复杂,难以达到对基因组进行快速高效编辑的目的。CRISPR/Cas9是近年来兴起的研究热门,它具有操作简单,成本低廉等特点,使得高效编辑罗伯茨绿僵菌基因组成为一个可实现的目标。本研究的目的是在罗伯茨绿僵菌中建立有效的CRISPR/Cas9基因组编辑系统,将Cas9蛋白序列及sgRNA序列通过农杆菌转化法导入罗伯茨绿僵菌中,并检验其编辑功能的效果,主要取得了以下几点结果:(1)从与罗伯茨绿僵菌相近虫生真菌构建的CRISPR/Cas9系统文献中得到Cas9蛋白基因序列,对Cas9蛋白基因序列进行优化,最后得到适合导入罗伯茨绿僵菌的Cas9蛋白基因序列;(2)分两步先将Cas9蛋白的基因序列导入罗伯...

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【学位级别】：硕士

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摘要
abstract
1 文献综述
    1.1 基因组编辑技术的概念及发展历史
        1.1.1 基因编辑技术的概念
        1.1.2 ZFN基因组编辑技术
        1.1.3 TALEN基因组编辑技术
    1.2 CRISPR/Cas9基因组编辑技术
        1.2.1 CRISPR/Cas9系统的结构及作用机理
        1.2.2 CRISPR/Cas9系统的优势与不足
    1.3 CRISPR/Cas9 系统在丝状真菌基因组编辑中的研究进展
        1.3.1 丝状真菌基因组编辑中的限制因素
        1.3.2 CRISPR/Cas9系统在丝状真菌基因组编辑中的应用
    1.4 虫生真菌中 CRISPR/Cas9 基因组编辑系统的研究现状
    1.5 研究的目的和意义
2 实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 供试菌株和载体
        2.1.2 主要化学试剂与生物试剂
        2.1.3 培养基配方及制作方法
        2.1.4 主要试剂配方
        2.1.5 实验仪器及设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 菌株保藏方法
        2.2.2 PCR扩增体系和条件
        2.2.3 DNA片段回收
        2.2.4 限制性内切酶酶切体系
        2.2.5 T4DNALigase连接反应体系
        2.2.6 AGL-1农杆菌介导转化法导入质粒
        2.2.7 绿僵菌DNA的提取
        2.2.8 绿僵菌RNA的提取
        2.2.9 绿僵菌 Cas9 蛋白印记检测（Western Blot）
3 实验结果
    3.1 两步法构建罗伯茨绿僵菌CRISPR/Cas9基因组编辑系统
        3.1.1 Cas9蛋白表达载体的构建
        3.1.2 Cas9-bar质粒导入罗伯茨绿僵菌
        3.1.3 Cas9序列表达验证
        3.1.4 sgRNA表达载体的构建
        3.1.5 sgRNA-ben质粒导入插入了Cas9序列的罗伯茨绿僵菌
        3.1.6 阳性转化子与野生型的表型对照
    3.2 一步法构建罗伯茨绿僵菌CRISPR/Cas9基因组编辑系统
        3.2.1 Cas9-bar-gRNA-EGFP质粒的构建
        3.2.2 EGFP-bar质粒的构建
        3.2.3 Cas9-bar-gRNA-EGFP质粒和EGFP-bar质粒导入罗伯茨绿僵菌
        3.2.4 蛋白印记检测验证Cas9蛋白的存在
        3.2.5 阳性转化子与空白对照的GFP蛋白表达验证
4 讨论
    4.1 Cas9蛋白及sgRNA的载体构建
    4.2 蛋白印记检测验证Cas9蛋白的存在
    4.3 sgRNA启动子的改进
5 结论
参考文献
致谢
作者简介



本文编号：3782694