AcMNPV及宿主细胞Sf9中增殖细胞核抗原PCNA的功能研究

发布时间：2023-05-04 02:14

　　增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)起初在患有系统性红斑狼疮患者的血清中发现,之后在其他物种(如哺乳动物,果蝇等)中也发现了它的存在。由于PCNA蛋白结构在进化上的保守性,使得病毒和原核细胞中也具有类似PCNA的DNA聚合酶辅助因子。在不同进化水平的生物中,它们具有相同的二级结构单位—?螺旋和?折叠,和相似的三级结构(一个可以在DNA链上滑动的环形滑动夹)。哺乳动物的PCNA以同源三聚体的形式存在于细胞核,是DNA合成不可或缺的因子,它的表达水平与细胞周期的变化同步。在杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)中鉴定有与编码增殖细胞核抗原蛋白序列同源的基因pcna,又称AcOrf-49,全长771 bp,但是在DNA复制中的作用还不明确。在杆状病毒的长期进化过程中,其基因组中的某些基因会发生高频率的缺失和获得。其中,AcMNPV的pcna基因(Ac-pcna)就是由其宿主Sf9(Spodoptera fr...

【文章页数】：119 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 杆状病毒
        1.1.1 杆状病毒概述
        1.1.2 杆状病毒分类地位
        1.1.3 杆状病毒发育循环
        1.1.4 杆状病毒病毒粒子相关蛋白分类
        1.1.5 昆虫杆状病毒表达载体系统
    1.2 杆状病毒基因组DNA复制和基因表达调控相关基因
        1.2.1 杆状病毒DNA复制原点hr
        1.2.2 杆状病毒基因表达调控的级联模型
        1.2.3 早期表达调节基因:ie2
    1.3 增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)
        1.3.1 增殖细胞核抗原的发现与结构特征
        1.3.2 增殖细胞核抗原的生物学功能
        1.3.3 AcMNPV和Sf9细胞的增殖细胞核抗原
    1.4 反式转录因子P53
        1.4.1 病毒感染与宿主细胞凋亡
        1.4.2 宿主细胞凋亡与P53蛋白
    1.5 病毒感染与葡萄糖代谢
        1.5.1 病毒感染对细胞葡萄糖转运的调节
        1.5.2 病毒感染对细胞葡萄糖代谢的调节
    1.6 昆虫杆状病毒表达载体系统的新进展
    1.7 论文的设计思路
        1.7.1 研究内容与意义
        1.7.2 研究方法
        1.7.3 实验流程
        1.7.4 研究创新点
第二章 重组杆状病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP的构建与核蛋白Ac/Sf-PCNA-EGFP的表达分析
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 主要实验仪器
        2.2.2 主要试剂及其配置
        2.2.3 细胞、病毒、菌株及载体
    2.3 实验方法
        2.3.1 Ac/Sf-pcna的序列分析和其蛋白三维结构同源建模
        2.3.2 昆虫Sf9细胞的培养
        2.3.3 重组病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP的构建
        2.3.4 蚀斑法测定重组病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP的滴度
        2.3.5 荧光显微镜观察和Westernblot检测Ac/Sf-PCNA-EGFP在AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9宿主细胞中的表达量
        2.3.6 Western blot检测在AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9宿主细胞中Ac/Sf-pcna-EGFP在核内的聚集情况
    2.4 实验结果
        2.4.1 Ac/Sf-pcna的序列分析及其蛋白三维结构模型
        2.4.2 重组病毒AcMNPV-Ac-pcna-EGFP的构建
        2.4.3 重组病毒AcMNPV-Sf-pcna-EGFP的构建
        2.4.4 AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9细胞中Ac/Sf-PCNA-EGFP的表达量分析
        2.4.5 AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9细胞中Ac/Sf-PCNA-EGFP在核内聚集的分析
    2.5 讨论
第三章 增殖细胞核抗原Ac/Sf-pcna的功能分析
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 主要实验仪器
        3.2.2 主要试剂及其配制
        3.2.3 细胞、病毒、菌株、载体和虫卵
    3.3 实验方法
        3.3.1 绝对定量PCR检测用标准质粒pUCm-T-hr3、pUCm-T-hsp90的构建
        3.3.2 Sf9细胞的培养
        3.3.3 绝对定量PCR检测在细胞内及外分泌的重组病毒的基因组DNA的复制水平
        3.3.4 绝对定量PCR检测重组病毒对Sf9基因组DNA复制的影响
        3.3.5 蚀斑实验检测重组杆状病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP对子代病毒增殖的影响
        3.3.6 Real-time PCR 检测重组杆状病毒Ac MNPV-Ac-pcna-EGFP对Ac MNPV晚期基因 38K、vp39转录水平的影响
        3.3.7 Real-time PCR检测重组杆状病毒Ac MNPV-Ac-pcna-EGFP对Ac MNPV极早期基因ie2转录水平的影响
        3.3.8 虫试实验检测重组杆状病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP的抗虫活性
    3.4 实验结果
        3.4.1 绝对定量PCR检测用标准质粒pUCm-T-hr3和pUCm-T-hsp90的构建
        3.4.2 重组病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP对病毒基因组DNA复制的影响分析
        3.4.3 重组病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP对Sf9基因组DNA复制的影响分析
        3.4.4 重组病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP对子代病毒增殖的影响分析
        3.4.5 增殖细胞核抗原Ac-pcna对AcMNPV晚期基因38K、vp39以及极早期基因ie2转录水平的影响分析
        3.4.6 重组杆状病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP的抗虫效率分析
    3.5 讨论
第四章 重组杆状病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP对宿主Sf9细胞凋亡蛋白SfP53表达、葡萄糖代谢及外源蛋白表达的影响
    4.1 引言
    4.2 实验材料
        4.2.1 主要实验仪器
        4.2.2 主要试剂及其配置
        4.2.3 细胞、病毒
    4.3 实验方法
        4.3.1 Sf9细胞的培养
        4.3.2 Western blot分析重组病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9细胞中SfP53的表达
        4.3.3 Western blot分析重组病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9细胞中核内SfP53的积累
        4.3.4 重组病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9细胞中葡萄糖含量的分析
        4.3.5 Western blot分析不同感染复数的AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9细胞中外源蛋白Renilla Luciferase的表达
        4.3.6 Western blot分析在AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染Sf9细胞的过程中外源蛋白Renilla Luciferase的表达
    4.4 实验结果
        4.4.1 重组病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9细胞中SfP53的表达量分析
        4.4.2 重组病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9细胞中核内SfP53的积累分析
        4.4.3 重组病毒AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9细胞中葡萄糖含量的分析
        4.4.4 不同感染复数的AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染的Sf9细胞中外源蛋白Renilla Luciferase的表达量分析
        4.4.5 在AcMNPV-Ac/Sf-pcna-EGFP感染Sf9细胞的过程中外源蛋白Renilla Luciferase的表达量分析
    4.5 讨论
总结与展望
参考文献
附录
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
个人简况及联系方式



本文编号：3807744