普城沙雷氏菌G3菌株GGDEF/EAL结构域蛋白PigX的功能研究

发布时间：2023-05-12 17:49

　　化学农药和化肥的过度使用已经对环境和食品安全构成严重威胁。开发利用环境友好的有益微生物进行植物病害生物防治作为化学防治的替代或补充,有利于农业可持续发展、维护生态平衡和保障食品安全性。但是生防微生物也存在抗菌谱狭窄、生防活性不稳定等缺点。因此筛选新的靶标基因构建具有高效和稳定生防活性的工程菌株具有重要的理论价值和应用前景。GGDEF/EAL结构域蛋白在细菌中广泛存在,大量研究已表明它们参与调控细菌运动性、生物膜形成、致病性、细胞分化和增殖等多种生命活动。然而,在植病生防菌中GGDEF/EAL结构域蛋白的相关研究至今尚未见报道。普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica) G3是分离自小麦内茎的内生菌,能够产生多种抗真菌因子如蛋白酶、几丁质酶、硝吡咯菌素(pyrrolnitrin, PRN),以及植物促生物质吲哚乙酸IAA与乙偶姻,因而具有一定的生防和促生潜能。前期研究已表明QS系统、Rsm系统、Hfq和RpoS等全局调控因子参与调控G3菌株的生防活性。通过分析S. plymuthica G3基因组序列鉴定了一个编码GGDEF/EAL结构域蛋白质的基因pigX,但是功能未知。本...

【文章页数】：149 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩写与符号
第一章 前言
    1.1 内生菌及其生物防治
        1.1.1 内生菌的作用
        1.1.2 内生菌生防活性的调控
    1.2 细菌GGDEF/EAL结构域蛋白
        1.2.1 二鸟苷酸环化酶(DGC)
        1.2.2 磷酸二酯酶(PDE)
        1.2.3 含GGDEF/EAL结构域的c-di-GMP效应蛋白
        1.2.4 CsrD家族蛋白
        1.2.5 c-di-GMP的功能
        1.2.6 c-di-GMP的信号通路与其他调控系统的相互作用
    1.3 普城沙雷氏菌与生物防治
    1.4 研究目的、主要内容和技术路线
        1.4.1 研究目的与意义
        1.4.2 主要研究内容
        1.4.3 主要技术路线
第二章 S.plymuthica pigX突变体构建及表型鉴定
    2.1 材料与仪器
        2.1.1 菌株、质粒、引物和培养基
        2.1.2 主要实验仪器
        2.1.3 主要试剂
    2.2 方法
        2.2.1 pigX基因的克隆和生物信息学分析
        2.2.2 pigX自杀性载体的构建
        2.2.3 pigX::Gm突变体的筛选
        2.2.4 pigX::Gm突变体互补菌株的构建
        2.2.5 蛋白酶活性和几丁质酶活性检测
        2.2.6 运动性检测
        2.2.7 生物膜形成(biofilm formation)
        2.2.8 AHLs信号分子检测
        2.2.9 真菌对峙实验
        2.2.10 PRN的提取和TLC检测
        2.2.11 IAA检测
        2.2.12 普里斯考尔试验(Voges Proskauer test,VP)检测乙偶姻
        2.2.13 pigX::Gm/pUCP26-csrD的构建及表型检测
    2.3 结果
        2.3.1 pigX克隆和生物信息学分析
        2.3.2 突变体pigX::Gm的构建和验证
        2.3.3 突变体pigX::Gm互补菌株pigX::Gm/pUCP26-pigX的构建
        2.3.4 PigX正调节蛋白酶和几丁质酶的活性
        2.3.5 PigX正调控swimming和swarming运动
        2.3.6 PigX负调控生物膜的形成
        2.3.7 PigX对AHLs信号分子合成的影响
        2.3.8 PigX正调控抑菌性和抗生素PRN生物合成
        2.3.9 PigX负调控IAA的合成
        2.3.10 PigX负调控乙偶姻的合成
        2.3.11 E.coli CsrD能够部分恢复突变体pigX：：Gm的活性
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 转录或翻译融合分析PigX的调控作用
    3.1 材料与仪器
    3.2 方法
        3.2.1 构建△lacZ突变体
        3.2.2 构建lux-、lacZ-的启动子报告基因
        3.2.3 PigX对flhDC转录和翻译的影响
        3.2.4 PigX对prnA转录和翻译的影响
        3.2.5 PigX对splI和spsI转录的影响
        3.2.6 PigX与Rsm调控系统相互作用
        3.2.7. PigX与Hfq相互作用
        3.2.8 RpoS对pigX转录与翻译的影响
        3.2.9 PigX自我调控
    3.3 结果与分析
        3.3.1 PigX正调控flhDC的表达
        3.3.2 PigX正调控prnABCD操纵子
        3.3.3 PigX正调控splI和spsI的转录
        3.3.4 PigX与Rsm调控系统相互作用
        3.3.5 PigX与Hfq的相互正调控
        3.3.6 RpoS负调控PigX
        3.3.7 PigX自我正调控
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 蛋白质组学分析S.plymuthica G3 PigX的功能
    4.1 材料
        4.1.1 试剂与仪器
        4.1.2 实验材料
        4.1.3 二维电泳相关试剂及其配制方法
    4.2 方法
        4.2.1 细菌全蛋白的提取
        4.2.2 蛋白质浓度测定
        4.2.3 细菌全蛋白二维电泳
        4.2.4 蛋白点的质谱分析
        4.2.5 差异蛋白的生物信息学分析
        4.2.6 鞭毛蛋白的验证
        4.2.7 超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性测定
        4.2.8 翻译融合验证LrhA蛋白
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 细菌总蛋白的差异蛋白表达谱分析
        4.3.2 差异蛋白的质谱鉴定
        4.3.3 差异蛋白质点的生物信息学分析
        4.3.4 差异蛋白质分析与讨论
    4.4 小结
第五章 总结与展望
    总结
    展望
    创新点
参考文献
致谢
在读期间发表的文章及参与的课题



本文编号：3814341