基于CRISPR/Cas9技术的橘小实蝇生殖发育相关基因的功能研究

发布时间：2023-08-17 20:36

　　橘小实蝇是一种危险性的果蔬害虫,给农业生产带来了巨大的经济损失。CRISPR/Cas9基因编辑技术的迅猛发展为农业害虫的科学防治带来了新的发展契机。本研究以橘小实蝇生殖发育相关的三个目标基因(boule、rhomboid、sex peptide receptor)为对象,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究其功能,探讨CRISPR/Cas9在橘小实蝇研究中的可行性,比较这些基因编辑敲除后对橘小实蝇生殖功能的影响,筛选为未来建立橘小实蝇遗传防控,特别是基于CRISPR/Cas9基因编辑的绿色防控技术提供靶基因。研究结果如下:1.克隆获得Bdbol基因,发现其在精巢表达量最高,显著性高于卵巢的表达量。筛选得到了两个高活性sgRNA(B-sg2、B-sg5)用于CRISPR/Cas9基因敲除。在突变品系G0中有64.70%的个体发生了基因突变,其中突变个体的平均嵌合率达到了63.42%。突变体Bdbol^-雄虫回交后代G1的胚胎孵化率出现了显著的降低(Student’s t-test,P<0.05),甚至于完全不孵化。精子活力检测发现Bdbol^-

【文章页数】：101 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1 橘小实蝇概述
    2 boule基因
    3 rhomboid基因
    4 spr(sex peptide receptor)基因
    5 CRISPR/Cas9 基因编辑技术
        5.1 CRISPR/Cas9 系统的发现及原理
        5.2 CRISPR/Cas9 技术方法及优缺点
        5.3 CRISPR/Cas9 技术在昆虫中的应用
    6 研究内容与目的意义
        6.1 本研究的内容与目的意义
        6.2 技术路线
第二章 材料与方法
    1 实验材料
    2 实验方法
第三章 结果与分析
    1 目的基因的克隆与分析
        1.1 Bdbol基因序列分析
            1.1.1 Bdbol基因克隆
            1.1.2 Bdbol基因系统进化树
            1.1.3 Bdbol基因蛋白序列比对分析
        1.2 Bdbol基因时空表达模式分析
        1.3 Bdrho基因序列分析
            1.3.1 Bdrho基因克隆
            1.3.2 Bdrho基因系统进化树
            1.3.3 Bdrho基因蛋白序列比对分析
        1.4 Bdrho基因时空表达模式分析
        1.5 Bdspr基因序列分析
            1.5.1 Bdspr基因克隆
            1.5.2 Bdspr基因系统进化树
            1.5.3 Bdspr基因蛋白序列比对分析
        1.6 Bdspr基因时空表达模式分析
    2 突变品系的建立
        2.1 sgRNA的设计与筛选
            2.1.1 目的基因靶标位点设计
            2.1.2 体外合成获得sgRNA
            2.1.3 sgRNA体外活性分析
        2.2 Cas9 mRNA合成及RNPs复合体制备
        2.3 胚胎显微注射建立突变品系
    3 突变体基因型分析
        3.1 Bdbol基因敲除分析
            3.1.1 突变体片段删除分析
            3.1.2 T7E1 酶切分析
            3.1.3 分子克隆分析
        3.2 Bdrho基因敲除分析
            3.2.1 突变体片段删除分析
            3.2.2 T7E1 酶切分析
            3.2.3 分子克隆分析
        3.3 Bdspr基因敲除分析
            3.3.1 突变体片段删除分析
            3.3.2 T7E1 酶切分析
            3.3.3 分子克隆分析
        3.4 脱靶效应分析
        3.5 靶基因突变效应比较
    4 目的基因敲除对生殖的影响
        4.1 对橘小实蝇生殖能力的影响
            4.1.1 Bdbol^-对生殖能力的影响
            4.1.2 Bdrho^-对生殖能力的影响
            4.1.3 Bdspr^-对生殖能力的影响
            4.1.4 靶基因突变体生殖能力比较
        4.2 对橘小实蝇生殖系统发育的影响
            4.2.1 Bdbol^-对生殖系统发育的影响
            4.2.2 Bdrho^-对生殖系统发育的影响
            4.2.3 Bdspr^-对生殖系统发育的影响
    5 小结与讨论
第四章 总结与展望
    1 总结
    2 创新点
    3 展望
参考文献
攻读学位期间已发表论文
致谢



本文编号：3842541