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赤拟谷盗dsRNA吸收机制及相关基因功能的研究

发布时间:2023-08-25 23:59
  基因沉默是真核生物中相对保守的机制之一。赤拟谷盗具有非常敏感的基因沉默效应。但是对于dsRNA的吸收机制尚不清楚。本研究利用内吞作用抑制剂并结合基因沉默技术(RANi)来研究赤拟谷盗dsRNA的吸收机制。结果表明网格蛋白介导的内吞作用抑制剂氯丙嗪和巴佛洛霉素A可以有效阻止赤拟谷盗细胞吸收dsRNA进而影响其靶标基因沉默效率,同时赤拟谷盗中肠组织切片也显示应用以上两种内吞作用抑制剂后,中肠细胞中没有释放Cy3荧光信号,该结果更为直观的证明了氯丙嗪和巴佛洛霉素A可以阻止细胞吸收dsRNA。上述结果初步证实了网格蛋白介导的内吞作用参与dsRNA的吸收过程,因此我们从该途径中选取了4个相对重要的蛋白,即衔接蛋白2中的μ链(TcAP50)、网格蛋白重链(TcChc)、V型ATP酶H亚基(TcVhaSFD)和Rab7(TcRab7)。利用基因沉默技术将以上参与蛋白分别沉默后发现,标靶基因的沉默效率显著降低。以上研究结果表明网格蛋白介导的内吞作用参与赤拟谷盗dsRNA的吸收过程。 幼虫巨大致死基因(lethal giant larvae)作为肿瘤抑制基因在上皮细胞极化过程中起着非常重要的作用。本研究...

【文章页数】:128 页

【学位级别】:博士

【文章目录】:
中文摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1 基因沉默(RNAi)简介
        1.1 RNAi的发现与发展
        1.2 RNAi的作用机制及特点
        1.3 RNAi的分类
        1.4 RNAi在昆虫学上应用
        1.5 植物传递的RNAi效应与害虫治理
        1.6 dsRNA的吸收机制
    2 幼虫巨大致死基因(Lethal giant larvae(Lgl))
    3 内吞作用(Endocytosis)
        3.1 内吞作用的机制
        3.2 内吞作用的分类
        3.3 网格蛋白介导的内吞作用(Clathrin-mediated endocytosis)
    4 本论文的研究意义
第二章 赤拟谷盗幼虫巨大致死基因(Lgl)的分子特性
    1 材料与方法
        1.1 供试虫源及饲养
        1.2 试剂与试剂盒
        1.3 试剂的配制
        1.4 主要仪器
        1.5 引物设计
        1.6 总RNA的提取与cDNA第一链的合成
        1.7 PCR扩增、产物回收纯化、连接及转化
        1.8 克隆PCR和质粒提取
    2 结果与分析
        2.1 总RNA的提取
        2.2 扩增目的条带
        2.3 赤拟谷盗TcLgl的cDNA序列及推导的蛋白序列
        2.4 赤拟谷盗TcLgl的基因组结构
        2.5 几种昆虫Lgl的氨基酸序列比对
        2.6 昆虫Lgl的遗传发育树分析
    3 讨论
第三章 赤拟谷盗Lgl基因的表达量分析
    1 材料与方法
        1.1 供试虫源及饲养
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器
        1.4 总RNA的提取与cDNA第一链的合成
        1.5 荧光定量PCR引物设计
        1.6 不同发育时期、不同组织TcLgl基因表达量测定(RT-qPCR)
    2 结果与分析
        2.1 不同发育时期、不同组织TcLgl的相对表达量
    3 讨论
第四章 赤拟谷盗Lgl基因的功能研究
    1 材料与方法
        1.1 供试虫源及饲养
        1.2 主要仪器
        1.3 主要试剂
        1.4 含T7启动子的模板DNA制备
        1.5 dsRNA的制备
        1.6 显微注射及实验设计
        1.7 mRNA水平检测沉默效率
    2 结果与分析
        2.1 dsRNA的合成
        2.2 dsRNA介导的TcLgl沉默对早期幼虫存活率的影响
        2.3 dsRNA介导的TcLgl沉默对末龄幼虫化蛹率的影响
        2.4 dsRNA介导的TcLgl沉默对早期蛹羽化率的影响
    3 讨论
第五章 赤拟谷盗内吞作用相关基因的分子特性
    1 材料与方法
        1.1 供试虫源及饲养
        1.2 试剂与试剂盒
        1.3 试剂的配制
        1.4 主要仪器
        1.5 引物设计
        1.6 总RNA的提取与cDNA第一链的合成
        1.7 PCR扩增、产物回收纯化、连接及转化
        1.8 克隆PCR和质粒提取
    2 结果与分析
        2.1 赤拟谷盗网格蛋白重链基因(TcChc)
        2.2 赤拟谷盗衔接蛋白基因(TcAP50)
        2.3 赤拟谷盗V型ATP酶亚基H基因(TcVhaSFD)
        2.4 赤拟谷盗Rab7
    3 讨论
第六章 赤拟谷盗内吞作用相关基因表达量分析
    1 材料与方法
        1.1 供试虫源及饲养
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器
        1.4 总RNA的提取与cDNA第一链的合成
        1.5 荧光定量PCR引物设计
        1.6 不同发育时期、不同组织内吞作用相关基因表达量测定(RT-qPCR)
    2 结果
        2.1 不同发育时期、不同组织TcChc基因相对表达量
        2.2 不同发育时期、不同组织TcAP50基因相对表达量
        2.3 不同发育时期、不同组织TcVhaSFD基因相对表达量
        2.4 不同发育时期、不同组织TcRab7基因表达量
    3 讨论
第七章 赤拟谷盗内吞作用相关基因的功能研究
    1 材料与方法
        1.1 供试虫源及饲养
        1.2 主要仪器
        1.3 主要试剂
        1.4 含T7启动子的模板DNA制备
        1.5 dsRNA的制备
        1.6 显微注射及实验设计
        1.7 mRNA水平检测沉默效率
        1.8 赤拟谷盗卵巢组织的解剖与染色
    2 结果与分析
        2.1 赤拟谷盗网格蛋白重链基因的功能
        2.2 赤拟谷盗AP50基因的功能
        2.3 赤拟谷盗VhaSFD基因的功能
        2.4 赤拟谷盗Rab7基因的功能
    3 讨论
第八章 赤拟谷盗dsRNA吸收机制的药理学研究
    1 材料与方法
        1.1 供试虫源及饲养
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器
        1.4 总RNA的提取与cDNA第一链的合成
        1.5 荧光定量PCR引物设计
    2 结果与分析
        2.1 氯丙嗪(Chlorpromazine)
        2.2 甲基-β-环糊精(Methyl-β-cyclodextrin)
        2.3 巴佛洛霉素A(Bafilomycin A1)
        2.4 细胞松弛素D(Cytochalasin D)
    3 讨论
第九章 赤拟谷盗dsRNA吸收机制的荧光定位分析
    1 材料与方法
        1.1 供试虫源及饲养
        1.2 主要仪器
        1.3 主要试剂
        1.4 Cy3标记dsRNA制备
        1.5 赤拟谷盗中肠组织切片制作
    2 结果与分析
        2.1 Cy3标记dsRNA的合成
        2.2 赤拟谷盗中肠组织切片
    3 讨论
第十章 赤拟谷盗dsRNA吸收的分子机制
    1 材料与方法
        1.1 供试虫源及饲养
        1.2 主要仪器
        1.3 主要试剂
        1.4 含T7启动子的模板DNA制备
        1.5 dsRNA的制备
        1.6 显微注射及实验设计
        1.7 mRNA水平检测沉默效率
    2 结果与分析
        2.1 不同长度dsRNA的合成
        2.2 不同长度dsRNA对靶标基因沉默效率的影响
        2.3 网格蛋白介导的内吞作用对靶标基因沉默效率的影响
        2.4 赤拟谷盗dsRNA的吸收机制
    3 讨论
全文总结与展望
    1 总结
    2 本研究创新之处
    3 问题与展望
参考文献
致谢
附录Ⅰ 本论文所用引物列表
附录Ⅱ 本论文克隆的所有基因序列
作者简介



本文编号:3843552

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