核盘菌低毒菌株SX466的生物学特性及所含真菌病毒的相关研究

发布时间：2024-07-05 21:43

　　核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的菌核病是油菜等许多作物上的重要病害,目前对这一病害缺乏经济、有效及稳定的防治措施,急需探讨新的防治策略。利用由真菌病毒引起核盘菌致病力衰退,对生物防治菌核病具有潜在的应用价值。本研究以陕西省汉中市发病油菜茎秆内菌核分离的SX466为材料,它的菌丝为短绒毛状、菌落边缘致密、表面上形成大量白色气生菌丝、菌丝尖端弯曲、菌丝生长速度缓慢、不产生菌核、致病力弱、表现出明显的低毒现象。经克隆分析发现它携带了三种真菌病毒:Sclerotinia sclerotiorum megabirna virus 1(Ss MBV1),基于Rd Rp的进化分析,清楚的表明它和Rosellinia necatrix megabirnavirus 1(Rn MBV1)亲缘关系最近,相似率44%;Sclerotinia sclerotiorum mitovirus 2/SX466(Ss MV2/SX466)和Sclerotinia sclerotiorum mitovirus 2的另两个种同源性高度92%;Sclerotinia sclerotiorum...

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【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1 核盘菌和菌核病的研究进展
        1.1 核盘菌的危害及致病机理
            1.1.1 核盘菌的危害
            1.1.2 核盘菌的致病机理
        1.2 菌核病的防治
            1.2.1 抗病品种选育
            1.2.2 农业防治
            1.2.3 化学防治
            1.2.4 生物防治
    2 真菌病毒的研究进展
        2.1 真菌病毒的分类
        2.2 真菌病毒与病原真菌的互作
            2.2.1 重要的病原真菌-真菌病毒互作系统
                2.2.1.1 Cryphonectria parasitica - CHV1/EP713互作系统
                2.2.1.2 Helminthosporium victoriae-Hv V190S互作系统
                2.2.1.3 Rosellinia necatrix-My RV3互作系统
                2.2.1.4 Sclerotinia sclerotiorum-Ss DRV和Sclerotinia sclerotiorum-Ss HDV-1 互作系统
                2.2.1.5 Botrytis cinerea-BVF互作系统
                2.2.1.6 Fusarium graminearum -Fg V1互作系统
            2.2.2 基因沉默的病毒抑制子
        2.3 卫星RNA病毒
        2.4 真菌病毒的传播
        2.5 真菌病毒与病毒进化
        2.6 高通量转录组测序在中生物学领域的应用
        2.7 真菌病毒与生物防治
    3 本研究目的与意义
第二章 核盘菌低毒菌株SX466的生物学特性及SSMBV1的相关研究
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
            1.1.1 供试菌株
            1.1.2 供试植物
            1.1.3 主要试剂、酶及试剂盒
            1.1.4 培养基
            1.1.5 主要载体及引物
            1.1.6 主要仪器和设备
        1.2 试验方法
            1.2.1 菌株的分离、活化与培养
            1.2.2 菌落形态观察
            1.2.3 生长速度测定
            1.2.4 致病力测定
            1.2.5 菌丝中ds RNA的提取及纯化
            1.2.6 总RNA提取
            1.2.7 RT-PCR
            1.2.8 全长序列的克隆及序列拼接
                1.2.8.1 Ss MBV1的随机引物克隆
                1.2.8.2 Ss MBV1的特异性克隆
                1.2.8.3 Ss MBV1的末端序列克隆
                1.2.8.4 序列拼接与分析
            1.2.9 Ss MBV1水平传播能力的测定
            1.2.10原生质体制备
            1.2.11病毒粒体的提纯
                1.2.11.1 用蔗糖密度梯度法提取病毒粒体
                1.2.11.2 用氯化铯密度梯度法提取病毒粒体
            1.2.12病毒粒体的负染透射电镜观察（TEM）
            1.2.13病毒粒子的核酸的裂解检测
            1.2.14病毒粒体结构蛋白的检测
            1.2.15病毒粒子结构蛋白的指纹图谱分析（PMF）
            1.2.16 PEG介导病毒粒子转染核盘菌原生质体
            1.2.17 Northern杂交
                1.2.17.1 电泳、转膜及固定
                1.2.17.2 预杂交
                1.2.17.3 地高辛标记DNA探针
                1.2.17.4 杂交
                1.2.17.5 洗膜及显色
    2 结果与分析
        2.1 核盘菌低毒菌株SX466的生物学性状
            2.1.1 核盘菌低毒菌株SX466菌落形态异常和生长速度缓慢
            2.1.2 菌株SX466具有弱致病性
        2.2 SX466中的真菌病毒研究
            2.2.1 SX466携带真菌病毒且形成病毒粒体
            2.2.2 真菌病毒Ss MBV1的克隆和基因组结构分析
            2.2.3 Ss MBV1系统发育树
            2.2.4 L2-ds RNA/Ss MBV1中蛋白酶 3D结构预测
            2.2.5 L2-ds RNA的蛋白酶结构域系统进化分析
        2.3 菌株SX466中真菌病毒水平传播能力研究
            2.3.1 菌株SX466中真菌病毒可水平传播
            2.3.2 水平传播衍生菌株电镜观察和核酸裂解
        2.4 SSMBV1病毒粒体转染核盘菌原生质体研究
            2.4.1 病毒粒体直接侵染核盘菌原生质体
            2.4.2 转染子中含有球形病毒粒体及ds RNA
            2.4.3 病毒粒体的结构蛋白主要由ORF1编码
        2.5 SSMBV1序列具有特异性
    3 结论与讨论
        3.1 携带DSRNA的SX466表现低毒特性
        3.2 SSMBV1基因组解析及其分类地位界定
        3.3 L2-DSRNA可能是L1-DSRNA的卫星RNA
        3.4 水平基因转移
        3.5 真菌病毒在不同菌株间水平传播
第三章 核盘菌低毒菌株SX466中L2-DSRNA/SSMBV1的功能分析
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
            1.1.1 供试菌株
            1.1.2 供试植物
            1.1.3 主要试剂、酶及试剂盒
            1.1.4 培养基
            1.1.5 主要载体及引物
            1.1.6 主要仪器和设备
        1.2 试验方法
            1.2.1 菌株的活化与培养
            1.2.2 菌株的生物学性状测定
            1.2.3 RT-PCR和Real-Time PCR
            1.2.4 质粒的提取
            1.2.5 病毒基因沉默
                1.2.5.1 沉默载体构建
                1.2.5.2 农杆菌电击转化
                1.2.5.3 ATMT介导的真菌转化
                1.2.5.4 转化子的验证
            1.2.6 高通量转录组测序（RNA-Seq ）
    2 结果与分析
        2.1 DSRNA可以进行水平传播
        2.2 PEG介导病毒粒子转染核盘菌原生质体
            2.2.1 转染子生物学特性
            2.2.2 L2-ds RNA对L1-ds RNA累积量的影响
        2.3 病毒基因沉默对寄主核盘菌的影响
        2.4 转录组测序分析
            2.4.1 转录组数据q PCR验证
            2.4.2 差异基因的GO功能显著性富集分析
            2.4.3 差异基因的KEGG显著性富集分析
    3 结论与讨论
        3.1 L2-DSRNA的作用
        3.2 被真菌病毒感染前后的核盘菌中存在多个差异表达基因
        3.3 基因沉默对核盘菌的影响
第四章 低毒菌株SX466中其它真菌病毒研究
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
            1.1.1 供试菌株
            1.1.2 主要试剂、酶及试剂盒
            1.1.3 培养基
            1.1.4 主要载体及引物
            1.1.5 主要仪器和设备
        1.2 试验方法
            1.2.1 菌株的活化与培养
            1.2.2 真菌病毒克隆
    2 结果与分析
        2.1 SX466中其它真菌病毒研究
            2.1.1 M-ds RNA和S-ds RNA基因组的克隆
            2.1.2 Ss MV2/SX466和Ss PV/SX466系统发育树构建
        2.2 菌株SX466中M-DSRNA和S-DSRNA水平传播能力测定
    3 结论与讨论
第五章 结论与展望
    1 结论
        1.1 SX466的生物学特性和SSMBV1的基因组分析
            1.1.1 SX466的生物学特性
            1.1.2 Ss MBV1的基因组分析
        1.2 SSMBV1水平传播和体外传播
            1.2.1 Ss MBV1水平传播
            1.2.2 Ss MBV1体外传播
        1.3 L2-DSRNA/SSMBV1的功能研究
        1.4 SX466中M-DSRNA和S-DSRNA研究
    2 展望
参考文献
附录 1：结构蛋白指纹图谱分析
附录 2: SX466菌种中M-DSRNA和S-DSRNA部分基因组序列
致谢



本文编号：4001579